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目的和意义:原发性肝细胞肝癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率在恶性肿瘤中均居前列[1]。手术切除及肝移植被认为是最有效的治疗方案,但由于大多数肝癌发现晚、进展快,故而仅有少数患者可以成功施行手术切除或肝移植[2]。研究表明,肝癌的发生发展是一个涉及多基因多因素多步骤的过程,癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因等众多基因的异常激活或异常失活是肝癌发生的分子基础[3]。近年来对原发性肝细胞癌的基因治疗已成为研究热点之一,可通过RNA干扰抑制肿瘤细胞中特定基因的表达,观察其对肿瘤细胞的影响,进而推测该基因在肿瘤发生发展的作用,并针对该基因进行基因治疗研究。在前期的研究中,我们已经发现一条功能未知的基因BC047440,其在肝癌组织中呈高表达,且与肝癌的恶性程度呈正相关[4],本实验利用RNAi技术,以人BC047440基因为靶基因,设计BC047440基因特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA) [5],构建其短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行PCR及DNA测序鉴定;利用重组成功的慢病毒载体转染包装细胞293FT细胞,收集、浓缩病毒上清液;以293FT细胞中绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度,并测定其对人肝癌细胞株HepG2细胞最适感染复数(MOI);以最适MOI感染HepG2细胞,分BC047440-shRNA组、control-shRNA组和HepG2组,通过检测各实验组HepG2细胞中BC047440 mRNA及蛋白的表达,验证其对HepG2细胞中BC047440基因沉默的效果,并以MTT法检测绘制各组HepG2细胞生长曲线,观察沉默BC047440基因后对HepG2细胞生物学特性的影响,从而为进一步了解BC047440对HepG2细胞生物学行为的影响并探讨其作用机制、寻找肝癌治疗新途径奠定基础。方法:1.设计并合成针对人BC047440基因的特异性DNA寡核苷酸,连接到经Hpa I和Xho I双酶切线性化的pFU-GW-iRNA载体质粒上,转化大肠杆菌(escherichiacoli ,E.coli) DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行PCR及DNA测序鉴定。2.取重组慢病毒表达载体pFU-shBC047440载体,pHelper 1.0载体,pHelper 2.0载体与Opti-MEM混合;取Lipofectamine 2000试剂与Opti-MEM混合。将各载体与Lipofectamine 2000稀释液混合,室温下孵育20min,加入293FT细胞培养瓶中混匀,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。48 h后收集293FT细胞及其上清液,离心获得病毒浓缩液,分装后置-70℃冰箱中保存。3.重组慢病毒颗粒逐孔稀释滴度测定法感染293FT细胞,计算重组慢病毒颗粒的滴度。4.选取适当滴度的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,72、96 h后在普通光镜及对应荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光表达,选择细胞状态较好、绿色荧光表达率较高、强度较强的MOI值作为待测最适MOI值。以该MOI值感染一定数量HepG2细胞后,利用流式细胞仪(flow cytometry ,FCM)检测HepG2细胞绿色荧光蛋白表达阳性率及强度,最终确定最适MOI值。5.取HepG2细胞分为BC047440-shRNA组、control-shRNA组及HepG2组,分别加入对应重组慢病毒及对照慢病毒,96h后提取各组HepG2细胞总RNA及总蛋白行RT-PCR及Western blot检测。6.MTT法检测绘制各实验组HepG2细胞细胞生长曲线。结果:1.根据人BC047440基因mRNA序列,参考前期实验结果,选择1个靶点,设计并合成了1对互补的寡核苷酸模板,并重组到pFU-GW-iRNA慢病毒表达载体中。成功筛选出阳性克隆。2.在构建的重组慢病毒表达载体中,选取多个阳性克隆,经过PCR扩增及DNA测序,证实重组慢病毒表达载体构建成功。3.经293FT细胞包装构建成功的重组质粒,生产出慢病毒颗粒,并进行浓缩。采用逐孔稀释滴度测定法感染293FT细胞后,采集荧光显微镜下图像进行分析,计算出重组慢病毒颗粒的滴度为5×108TU/ml。4.选取适当滴度的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,可见当MOI值为20时,细胞状态最佳,荧光表达率较高,荧光强度较强;且随感染时间延长,细胞内荧光强度增加。故选取20作为待测最佳MOI,重新感染一定数量HepG2细胞96h后,于流式细胞仪下检测表达绿色荧光的HepG2细胞百分比为88.15%,荧光平均强度为33.0%,最终确定以MOI=20作为最适MOI值。5.通过RT-PCR、Western blot检测经慢病毒感染后HepG2细胞中BC047440表达情况,结果表明BC047440-shRNA组的BC047440 mRNA及蛋白表达量较control-shRNA组和HepG2组明显降低(抑制率58.96%),control-shRNA组和HepG2组间BC047440 mRNA及蛋白表达量无明显差异。6.MTT法检测并分析各实验组HepG2细胞生长曲线,发现BC047440-shRNA组HepG2细胞较control-shRNA组和HepG2组生长增殖减慢( p<0.05),control-shRNA组和HepG2组间无明显差异。结论:1.成功构建了BC047440基因特异性siRNA重组慢病毒。2.利用构建的重组慢病毒包装生产出慢病毒颗粒,并成功测定重组慢病毒颗粒滴度。证实了重组慢病毒颗粒可高效感染HepG2细胞。3.以最适MOI值感染HepG2细胞,经RT-PCR及Western blot检测,证实达到了特异性沉默人肝癌细胞株HepG2中BC047440基因表达的目的,并可使干扰组HepG2细胞生长增殖减慢,为进一步研究BC047440基因对HepG2细胞生物学行为的影响、探讨其作用机制、寻找肝癌治疗新途径奠定了基础。