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目的:通过观察当归有效部位(有机酸)对人脐静脉内皮细胞TLR4及其下游信号通路NF-κB、LOX-1、VCAM-1、MCP-1、IL-6表达的影响,探讨当归有效部位(有机酸)防治动脉粥样硬化的机制。方法:1.人脐静脉内皮细胞分离培养及内皮损伤模型建立:Ⅰ型胶原酶消化法分离得到原代人脐静脉内皮细胞,用免疫荧光法检测人第Ⅷ因子相关抗原进行细胞鉴定,用DMEM/F12培养基,在37℃、5%CO2条件下培养并传代。用不同浓度,即0、0.1、0.5、1、5、10μg/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激人脐静脉内皮细胞,使人脐静脉内皮细胞损伤。倒置显微镜下观察不同浓度LPS对内皮细胞的影响,免疫荧光技术检测LPS特异性配体TLR4的表达,确定内皮损伤模型适宜的LPS浓度。2.当归有机酸对损伤内皮的作用及机制研究:将人脐静脉内皮细胞随机分为5组,包括正常组,模型组,当归有效部位(有机酸)高、中、低浓度组。用(LPS 0.1μg/m L)诱导人脐静脉内皮细胞,激活TLR4及下游信号通路NF-κB、LOX-1、VCAM-1、MCP-1及IL-6,并用不同浓度当归有效部位(有机酸)进行干预,24h后分别用免疫荧光方法检测TLR4,NF-κB蛋白表达;用Western blot方法分别检测LOX-1,VCAM-1,MCP-1蛋白表达;用ELISA法检测细胞上清液中人IL-6含量。3.阿魏酸钠对损伤内皮的作用观察:将人脐静脉内皮细胞随机分为5组,包括正常组,模型组,阿魏酸钠高、中、低浓度组,用LPS(0.1μg/mL)诱导人脐静脉内皮细胞,激活TLR4及下游信号通路NF-κB、LOX-1、VCAM-1、MCP-1及IL-6,并用不同浓度阿魏酸钠标准品进行干预,24h后分别用免疫荧光方法检测TLR4,NF-κB蛋白表达;用Western blot方法分别检测LOX-1,VCAM-1,MCP-1蛋白表达;用ELISA法检测细胞上清液中人IL-6含量。结果:1.Ⅰ型胶原酶消化得到的人脐静脉内皮细胞,生长至融合状态时呈单层“铺路石样”排列,用免疫荧光法检测第Ⅷ因子相关抗原,证明消化所得是人脐静脉内皮细胞。不同浓度LPS刺激人脐静脉内皮细胞12小时(12h)和24h,人脐静脉内皮细胞受损程度随着LPS浓度的升高而加重,24h组LPS特异性受体TLR4蛋白表达明显高于12h组。2.LPS刺激人脐静脉内皮细胞24h,与空白对照组比较,模型组细胞TLR4及下游信号通路NF-κB、LOX-1、VCAM-1、MCP-1、蛋白表达、IL-6含量明显升高,用当归有效部位(有机酸)干预后,各治疗组细胞TLR4、NF-κB、LOX-1、VCAM-1、MCP-1蛋白表达、IL-6含量明显下降。3.用阿魏酸钠干预后各治疗组细胞TLR4、NF-κB、LOX-1、VCAM-1、MCP-1、IL-6表达蛋白明显下降。结论:当归有效部位(有机酸)通过下调损伤内皮细胞TLR4表达,抑制下游信号通路NF-κB活化,使LOX-1、VCAM-1、MCP-1、IL-6等分子表达下降。抑制炎症反应和脂质介导的动脉粥样硬化病理进程,当归有机酸的主要成分阿魏酸在其中发挥了主要作用。