论文部分内容阅读
随着同种器官移植在临床上的迅速发展,使器官需求量日益增加,伴随而来的同种异体器官的供应短缺也日益严重。异种移植是解决这一问题的潜在途径之一。猪凭借其解剖学和生理学上与灵长类高度相似的特点，被作为应用于器官移植的一种理想供体动物。近年来α-l，3-半乳糖转移酶基因(α-1，3-galactosyltransferase-knockout，GT-KO)敲除猪、表达人补体调节蛋白转基因猪的出现使得超急性免疫排斥反应不再是最主要的问题，异种移植后的凝血障碍更亟待解决。血栓调节蛋白(Thrombomodulin,TM)是存在于血管内皮细胞表面的一种具有很强抗凝活性的糖蛋白，可与凝血酶结合参与蛋白C途径调节凝血，在克服凝血紊乱的研究中起关键作用。本研究采用猪内源TM启动子调控hTM构建表达载体，通过核移植及胚胎移植技术成功制备了血管内皮特异性表达hTM的转基因克隆五指山小型猪，结果如下：研究一：本研究首先以大白猪TM基因座BAC为模板，通过PCR技术构建抓捕载体PBR322-catch，经序列测定，同源性为100%。再利用Red同源重组系统介导的“gap–repair”基因抓捕技术，从含大白猪TM基因座的BAC(细菌人工染色体)上亚克隆7kb的TM启动子，经酶切鉴定，大小与预期一致。研究二：通过PCR技术获得表达载体所需各元件的亚克隆片段，经T-A克隆，酶切、回收、酶连至克隆载体pBlueScriptⅡ（SK-）中，再将获得的完全同源的TM启动子连入表达载体中，构建完成含有嘌呤抗性（Puromycin，Puro）的血管内皮细胞特异性的表达载体pBS-hTM。研究三：将构建完成的抓捕载体经Xhol I线性化后，通过电击转染胎儿成纤维细胞系WPF176和WPF169，用含有1.0μg/mL嘌呤霉素筛选培养液进行约10~15天的筛选，共获得克隆点354个，经过PCR鉴定含有15个阴性细胞克隆点。研究四：以其中2个生长状态较好的hTM阳性细胞克隆做为供体细胞进行核移植，重构胚经融合激活后进行体外培养，其体外发育能力与普通重构胚无显著差异（P>0.05）。先后将972个重构胚移植到5头受体母猪体内，30天后B超检测怀孕2头，妊娠120天后共生产仔猪5头，其中1头死亡，其余4头生长状况良好，无畸形及其他异常状况。研究五：经新生仔猪耳组织基因组PCR鉴定，组织RT-PCR以及Western blot鉴定，5头仔猪中1头为阴性，其余4头均为阳性，且严格遵循血管内皮细胞的特异性表达。综上所述，本研究成功获得血管内皮特异性表达hTM基因的转基因克隆五指山小型猪，异种移植后的凝血紊乱问题有望解决，且显著延长术后的存活时间。为多基因修饰猪的制备奠定的实践基础，进一步推动异种移植在临床研究方面的发展。