4-羟基苯甘氨酸(HPG)单体以及含HPG生物聚酯的生物合成研究

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L-4-羟基苯甘氨酸(L-HPG)是一种非蛋白源性氨基酸,是合成一些新型抗癌药与非核糖体肽类抗生素(如万古霉素)的中间体,在医药领域有重要的应用前景。目前,L-HPG主要采用化学方法合成,成熟的生物合成方法还未实现。本研究从工程大肠杆菌出发,研究构建L-酪氨酸至L-HPG的生物合成方法。此外,L-HPG的羟基、羧基结构具有潜在的芳香族聚酯单体应用前景。因此,本研究探索了以L-HPG为单体的新型芳香族聚酯的生物合成。本研究的主要结果如下:(1)本研究将来自于天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(Hmas)、4-羟基扁桃酸氧化酶(Hmo)、4-羟基苯甘氨酸转移酶(Hpg T)的基因,重组至大肠杆菌底盘细胞,构建了产L-HPG的工程大肠杆菌。(2)从构建的产L-HPG的工程大肠杆菌出发,本研究进一步将来源于艰难梭状芽孢杆菌Clostridioides difficile ATCC 9689的2-羟基异己酸转移酶(Had A)和来源于假单胞菌属Pseudomonas sp.MBEL 6-19的PHA(PHAPs6-19)II型合成酶的基因重组至工程菌内,构建了可产含L-HPG单体的聚酯制备工程菌。(3)本实验从构建的产L-HPG的工程菌株出发,系统研究了L-HPG的发酵工艺,并对生物合成的L-HPG进行了定性定量分析。通过和标准品比较,液质和高效液相结果证实工程菌可以以L-酪氨酸为底物合成L-HPG。定量分析结果证实合成的目标产物L-HPG在摇瓶水平可达到0.47 g/L。(4)本研究从构建的含聚酯生物合成途径的工程菌出发进行了含L-HPG芳香族聚酯的发酵和分离分析研究。摇瓶水平的发酵虽然提取到终产物,但对产物的定性分析(核磁)结果证明合成的产物比较复杂,需要进行讨论分析,可能原工程菌使用的转移酶对L-HPG底物特异性较低,无法将L-HPG转化为辅酶化的活性单体用于聚酯合成。(5)本研究进一步更换了聚酯合成工程菌中的转移酶基因,但是发酵的产物中仍然没有我们预期的产物。研究结果证实本研究所筛选的聚酯合成途径无法成功合成含HPG单体的芳香族聚酯,提示所使用的转移酶和聚酯合成酶需要进一步优化以用于新型芳香族聚酯的生物合成。
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