目的：TPX2(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein2是一个受细胞周期严格调控并在细胞有丝分裂纺锤体形成过程中发挥重要作用的微管相关蛋白。有研究者发现其在某些恶性肿瘤中存在高表达,导致细胞中心体异常扩增、异倍体形成及细胞恶性转化,进而促进细胞增殖,影响周期和凋亡,并与肿瘤分化、转移和复发明显相关。阻断其表达可抑制止肿瘤细胞生长,有望成为肿瘤治疗的候选靶点。宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,其发生、发展和转归与多种因素有关。TPX2是否参与其中,目前国内外尚未见报道。本课题研究了TPX2在宫颈癌的表达及在体内外沉默后对宫颈癌细胞增殖、侵袭的影响,旨在为宫颈癌诊治开拓新的靶点。方法：本课题分总共分四部分,第一部分借助RT-PCR及免疫组化技术对宫颈癌组织、鳞癌siha细胞及腺癌hela细胞中的TPX2在的表达进行研究,并结合临床病理资料进行分析,以探讨TPX2在子宫颈癌中的表达情况及其与子宫颈癌患者临床分期、淋巴结转移及组织病理分化程度的关系,为宫颈癌的诊治提供新的依据。第二部分研究了在宫颈鳞癌siha细胞沉默TPX2基因后其生物学行为的变化。在体外合成TPX2特异性的siRNA四对,siRNA阴性对照一对。Lipofectamine2000介导siRNA转染siha细胞株。荧光显微镜测其转染效率。本实验所有检测项目都按如下分组：实验中以PBS代替转染剂(?)(?)siRNA混合物设置为空白对照组,转染阴性siRNA为阴性对照组,转染TPX2-siRNA者为实验组。RT-PCR检测转染前后mRNA表达的变化,并选择出最有效的siRNA做后续实验。Western blot检测转染前后蛋白表达的变化。MTT法检验TPX2-siRNA对siha细胞增殖活性的改变：每组设3个平行孔,将各组细胞分别接种至96孔板培养24小时,按照操作步骤进行转染,分别于转染后0小时、24小时、48小时、72小时、96小时,用酶联仪于570nm处检测各孔吸光度值,并据此绘制细胞生长曲线。流式细胞仪检测TPX2沉默后siha细胞的周期和凋亡的变化。Transwell体外侵袭实验测定TPX2沉默后siha细胞侵袭能力的改变：将各组细胞滴加于Matrigel包被的含有微孔滤膜的Transwell小室,培养24小时,95%乙醇固定,结晶紫染色,显微镜下计数各组穿膜细胞数。第三部分研究了TPX2-siRNA对人宫颈腺癌hela细胞体外生长的影响,方法同第二部分。为了进一步验证TPX2特异性的siRNA在体内对宫颈癌细胞生长的影响。第四部分研究了TPX2-siRNA对裸鼠皮下HeLa细胞移植瘤生长的影响。实验所用siRNA经2’Ome修饰,与lipo2000孵育后转染Hela细胞及瘤体内注射。实验裸鼠分组:TPX2-siRNA转染组(接种转染TPX2-siRNA的hela细胞成瘤),siRNA阴性对照组(接种转染阴性siRNA的hela细胞成瘤),TPX2-siRNA治疗组(接种hela细胞成瘤后,TPX2-siRNA瘤内定期注射治疗),空白对照组(接种hela细胞成瘤后,生理盐水瘤内定期注射治疗)。通过观察各组裸鼠皮下移植瘤的成瘤时间、绘制移植瘤体积生长曲线,移植瘤体积和重量的对比、RT-PCR、免疫组织化学法来研究TPX2-siRNA对TPX2基因的沉默效应及TPX2-siRNA对HeLa细胞裸鼠移植瘤的抑制效果。结果：第一部分①经RT-PCR检测,正常宫颈组织中TPX2mRNA的相对表达量为0.080±0.030,宫颈腺癌组织中TPX2mRNA表达为0.467±0.031,宫颈鳞癌组织中相对含量为0.441±0.011,HeLa细胞的表达为1.923±0.040,Siha细胞的表达为1.679±0.042,各组与正常宫颈组织比较均有统计学差异(P<0.01)。②经细胞免疫化学检测,TPX2蛋白在宫颈鳞癌Siha细胞和宫颈腺癌hela细胞系均呈阳性表达,定位于细胞核。免疫组化法检测TPX2蛋白在宫颈腺癌组织呈阳性表达,而正常宫颈腺上皮未见表达,两组间比较有统计学意义。TPX2蛋自在正常宫颈鳞状上皮组织中不表达,在CIN和宫颈鳞癌组织中阳性表达强度增加,三者之间差异具有显著性((P<0.05)。③TPX2在宫颈癌患者临床分期Ⅱ期的组织中的表达强度强于Ⅰ期(P(0.05)；TPX2蛋白在高、中、低分化三组间的表达强度渐增加,三组间比较有统计学意义,(P<0.05)；在有淋巴结转移组的表达强于无淋巴结转移组(P<0.05)。第二部分①在600μ L转染体积中,在siRNA浓度为20μmoL/L时,siRNA和Lipoectamine2000以2.5：2比例搭配时,siha细胞的转染效率24h为(97.13士1.82)%。②四对TPX2-siRNA尤以TPX2-siRNA4的TPX2mRNA沉默效果最强,TPX2mRNA抑制率为(84.9±0.73)%。③TPX2-siRNA4被转染后,siha细胞的TPX2蛋白表达被明显抑制,抑制率达(62.5±1.26)%。④MTT法测定TPX2siRNA4干扰TPX2基因对siha细胞增殖的影响：转染TPX2siRNA4组的siha细胞在转染24h后均即出现增殖减慢,48h吸光度开始出现下降趋势,细胞增殖受到抑制,且随着时间延长,抑制作用逐渐增强。在转染24、48、72、96h时间点的吸光度值均显著低于空白对照组及转染阴性siRNA对照组(P<0.05)。空白对照组及转染阴性siRNA对照组组均随着培养时间的延长,吸光度值逐渐增大,两组在转染24、48、72、96h各时间点比较均无统计学意义(p>0.05)。⑤Transwell小室法测定TPX2siRNA4干扰TPX2基因对siha细胞体外侵袭能力的影响：TPX2siRNA4转染siha细胞后使其侵袭重建基底膜能力受到显著抑制,Siha细胞侵袭到Transwell小室滤膜下的细胞数在TPX2-siRNA4转染组为(12.33±3.06)显著低于空白对照组(50.67±5.52)和阴性对照组(48.33±4.04)(P<0.05), siha细胞阴性对照组和空白对照组的穿膜细胞数比较无统计学差异,(P>0.05)。⑥流式细胞术检测TPX2-siRNA4对siha细胞周期分布的影响。经流式细胞仪检测分析,TPX2-siRNA4转染siha细胞后,其周期分布在各组也发生了明显的变化,TPX2-siRNA实验组与空白对照组及阴性对照组相比,G0/G1期细胞比例减少(P<0.05,),S期细胞及G2/M期细胞比例增多(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组在各组细胞比较无差异,(P>0.05)。⑦流式细胞术检测转染TPX2-siRNA对siha(?)田胞凋亡的影响：根据流式细胞仪检测siha不同组细胞凋亡情况的结果显示,TPX2-siRNA4转染siha细胞后TPX2-siRNA4转染组、siRNA阴性对照组、空白对照组的细胞凋亡率分别为10.45±0.63%、3.05±0.28%、2.26±0.46%,转染组细胞凋亡率明显高于阴性对照组的和空白对照组P<0.05),阴性对照组和空白对照组之间的细胞凋亡率无差异,不具有统计学意义(P>0.05)。第三部分TPX2-siRNA对人宫颈腺癌hela细胞体外生长的影响①TPX2-siRNA成功转染hela细胞,24h转染效率为(98.33±1.53)%②四对TPX2-siRNA尤以TPX2-siRNA4的TPX2mRNA沉默效果最强,TPX2mRNA抑制率为(82.5±0.43)%。③TPX2-siRNA4被转染hela后,其蛋白表达被明显抑制,抑制率达(63.4±1.05)%。④MTT法测定TPX2siRNA4干扰TPX2基因对hela细胞增殖的影响：转染TPX2siRNA4组的hela细胞在转染24h后均即出现增殖减慢,48h吸光度开始出现下降趋势,细胞增殖受到抑制,且随着时间延长,抑制作用逐渐增强。在转染24、48、72、96h时间点的吸光度值均显著低于空白对照组及转染阴性siRNA组(P<0.05)。空白对照组及转染阴性siRNA对照组组均随着培养时间的延长,吸光度值逐渐增大,两组在转染24、48、72、96h各时间点比较均无统计学意义(p>0.05)。⑤Transwell小室法测定TPX2siRNA4干扰TPX2基因对hela细胞体外侵袭能力的影响：TPX2siRNA4转染hela细胞后使其侵袭重建基底膜能力受到显著抑制,hela侵袭到Transwell小室滤膜下的细胞数在TPX2siRNA4转染组为(13.20±1.92)显著低于空白对照组(55.20±1.30)和阴性对照组(55.40±2.07)(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组之间的穿膜细胞数并无明显差异,(P>0.05)。⑥流式细胞术检测TPX2-siRNA4对hela细胞周期分布的影响。经流式细胞仪检测分析,hela细胞周期分布发生改变,与对照组相比,TPX2-siRNA4实验组细胞G0/G1期细胞比例下降(P<0.05,)S期细胞及G2/M期细胞比例上升(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组在各组细胞比较无差异(P>0.05)⑦流式细胞术检测转染TPX2-siRNA对hela细胞凋亡的影响：TPX2-siRNA4转染组、siRNA阴性对照组、空白对照组的细胞凋亡率分别为13.47%±0.60%、3.48%±0.55%、2.73%±0.51%,转染组细胞凋亡率明显高于阴性对照组的和空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组之间的细胞凋亡率无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。第四部分①各组裸鼠皮下移植瘤成瘤情况：转染组约在9.37±0.75天后于接种处可触及粟粒大小的结节,之后结节渐长大,即为建模成功,成瘤率为100%。其它三组均在接种约4天后可触及粟粒大小的结节,并渐长大,即为建模成功,各组成瘤率均为100%。转染组与其它三组成瘤时间比较,差异有统计学意义。②各组裸鼠皮下移植瘤体积生长曲线显示,空白组和阴性对照组生长速度较快,转染组和治疗组肿瘤的生长均不同程度的受到了抑制。③接种30天后各组裸鼠皮下移植瘤体积TPX2-siRNA转染组为252.13±27.45；TPX2-siRNA治疗组为133.45±7.41；空白对照组体积为1364.88±226.73; siRNA阴性对照组体积为1301.13±237.80,空白对照组和阴性对照组体积明现大于转染组和治疗组体积,差异有统计学意义(P<0.05)。④各组裸鼠移植瘤剥除后体积和质量比较：接种30天后,剥离各组肿瘤,测量瘤体和重量。转染组移植瘤体积为(61.88±25.70)mm3,重量为(52.93±18.90)g。治疗组移植瘤体积为(58.62±27.23)mm3重量为(41.95±12.97)g。空白对照组移植瘤体积为(608.25±359.38)mm3,重量为(452.7±111.72)g。阴性对照组移植瘤体积为(569.63±329.47)mm3,重量为(407.8±174.34)g。转染组和治疗组移植瘤的体积和重量分别比较无明显差异(P>0.05)。空白对照组和阴性对照组移植瘤的体积和重量分别比较无明显差异(P>0.05)。转染组、治疗组移植瘤的体积和重量与空白对照组、阴性对照组相比明显减小,其差异具有统计学意义(P<0.05)。⑤各组裸鼠移植瘤中TPX2mRNA的表达：TPX2一siRNA转染组、TPX2一siRNA治疗组TPX2mRNA和空白对照组、siRNA阴性对照组TPX2mRNA市目比均有统计学意义(P<0.05),TPX2-siRNA治疗组与TPX2-siRNA转染组相比具有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与siRNA阴性对照组相比,无统计学差异(P>05),⑥免疫组化检测各组裸鼠移植瘤中TPX2蛋白的表达：TPX2蛋白表达定位于细胞核,TPX2-siRNA转染组和治疗组TPX2蛋白的表达明显弱于空白对照组及siRNA阴性对照组(P<0.05),空白对照组与siRNA阴性对照组相比,无统计学差异(P>05)。结论：1.TPX2可能参与了宫颈癌的发生和发展,TPX2可作为宫颈癌诊断及恶性程度评估的一个指标。2.TPX2-siRNA在体外能抑制宫颈鳞癌siha细胞的增殖和侵袭,使细胞周期停顿于S期及G2-M期,并诱导细胞凋亡。3.TPX2-siRNA在体外能抑制宫颈腺癌hela细胞增殖和侵袭,使细胞周期停顿于S期及G2-M期,并诱导细胞凋亡。4.TPX2-siRNA能沉默裸鼠体内hela细胞移植瘤TPX2的表达,进而抑制裸鼠体内hela细胞移植瘤的生长。5.TPX2有望成为宫颈癌基因治疗的候选靶点,有潜在的临床应用前景。