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本文以协同抑制ACC氧化酶1的转基因番茄植株T4B-11和V1187(ACC Oxidase I co-suppression transgene tomato)、普通番茄植株(wild-tpye, WT)、乙烯反应突变体番茄Nr (never ripe)和rin (ripen inhibitor)为材料,克隆了与果实成熟及病程相关的番茄ACC氧化酶1、ACC氧化酶3、EBF1、PR1、PR5以及NP24基因片段,并以此制备探针,采用Northern杂交技术,同时进行乙烯释放量测定、果实贮藏试验、环境胁迫处理等,研究协同抑制番茄ACC氧化酶1对果实成熟相关基因和病程相关基因表达的影响,以及对内源乙烯合成和果实耐贮性的影响;环境胁迫因子以及乙烯处理对番茄ACC氧化酶1表达的影响。主要工作和结论如下:
(1) 与果实成熟及病程相关的番茄基因的克隆:以NCBI上发布的番茄ACC氧化酶1基因(LeACO1)、ACC氧化酶3基因(LeACO3)、EBF1(EIN3-binding F-box 1)基因、PR1(pathogenesis-related protein 1)基因、PR5(pathogenesis-related protein 5)基因以及NP24基因序列为依据,设计引物,从普通番茄中通过PCR或RT-PCR扩增出相应的基因片段。
(2) 协同抑制番茄ACC氧化酶1对果实成熟相关基因的影响:
分别以同位素标记的LeACO1, LeACO3和LeEBF1基因片段为探针,与WT和两个协同抑制ACO1番茄株系T4B-11-11、V1187在四个果实成熟时期(IMG;MG;B;B+4)的总RNA进行杂交。从结果可知协同抑制LeACO1对内源乙烯的生物合成、果实的成熟衰老程度及LeEBF1表达具有强烈的抑制作用;LeACO1基因可能是番茄果实成熟过程中的主要调节因子,LeACO1基因被抑制的同时,也同样阻断了与果实成熟有一定相关性的LeACO3的表达。
(3) 协同抑制LeACO1对与病程相关蛋白的影响
分别以同位素标记的PR1 , NP24和 PR5基因片段为探针,与WT和协同抑制ACO1番茄株系T4B-11-11在四个果实成熟时期(IMG;MG;B;B+4)的总RNA进行杂交。结果显示,三个PR基因在WT和T4B-11-11的成熟过程中表达各异。并可推断,PR基因的表达受到内源乙烯的诱导调控。
(4) 环境胁迫和乙烯对番茄ACC氧化酶1基因表达的影响:
克隆番茄ACC氧化酶1(LeACO1)基因特异片段,以此作为探针,通过Northern杂交,结果表明,LeACO1基因的表达被干旱抑制,被复水、外源乙烯强烈诱导;淹水处理对叶片中该基因的表达无影响,而强烈诱导其在茎中的表达;37℃高温处理可以诱导LeACO1基因在番茄茎中的表达;伤害对该基因的表达没有明显影响;外源乙烯能够诱导该基因在番茄MG时期果实中表达。
总之,从本研究对协同抑制LeACO1基因对果实成熟相关基因和病程相关基因,内源乙烯合成和果实耐贮性的影响;环境胁迫因子以及乙烯处理对番茄ACC氧化酶1表达的影响进行了较为完整的阐述。