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大豆南方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.meridionalis,DPM)、大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora,DPC)和拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla,PL)均为大豆上重要的茎部病原真菌。其中,大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌为我国公布的植物检疫性病原真菌,在欧洲和北美洲的国家广泛分布,严重影响大豆的生长和产量。大豆拟茎点种腐病菌是影响大豆生长的重要病原菌,每年对我国的大豆生产造成严重损失。对于三种病原菌的检测工作,当务之急就是一方面加强大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的口岸检疫,防止病原菌的入侵,另一方面要提高对大豆拟茎点种腐病菌的早期快速诊断技术水平,在病菌侵染初期准确诊断出病原菌的存在,降低经济损失。传统的以传统的以ITS(内转录间隔区)为靶序列的分子检测无法快速准确区分大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌等近似种。笔者在大豆北方茎溃疡病菌靶标序列筛选中,发现了翻译延伸因子(translation slongation factor la,tefla)序列。翻译延伸因子是信使核糖核酸翻译促进多肽链延伸的蛋白质因子,其在原核、真核生物中均有存在,具有高度的特异性,常常被用于多种病原菌的分类鉴定上。通过目标病原菌与其相似种比对发现,三种病原菌在tefla序列上都有很好的特异性,适合作为分子检测的靶标。基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以tefla为靶序列,针对三种病原物分别设计LAMP特异性引物,建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,在特异性的基础上分别进行了灵敏度验证、人工接种大豆植株检测试验和实际样本检测试验。在大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测中,64℃等温条件下进行核酸扩增反应60 min,反应结束后,加入SYBR green Ⅰ染料,根据染料颜色变化判定扩增结果。引物特异性验证试验中,只有目标菌株中扩增到梯形条带,同时加入SYBR green Ⅰ染料后可观察到绿色荧光的阳性反应;而在其他供试菌株中均没有出现梯形条带,加入SYBR green Ⅰ染料后则保持橙色的阴性反应。该技术在大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的最低检测限为10 pg·μL-1和1 pg·μL-1目标菌纯DNA。在对分别人工接种了大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌病菌的大豆植株发病组织的检测中,DPM-LAMP和DPC-LAMP技术能够检测出所有人工接种发病大豆植株中的目标菌。笔者又对口岸截获的大豆病残体进行了人工添加子囊孢子的试验,DPM-LAMP和DPC-LAMP技术能够分别在10 g进口大豆夹带的大豆植株残体中最低检测出大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的50个子囊孢子和10个子囊孢子。结果显示,该方法的建立为大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌的检疫以及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。在拟茎点种腐病菌的PL-LAMP检测中,在扩增反应前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果,引物特异性验证试验中,54株分离自不同省份的拟茎点种腐病菌菌株能观察到天蓝色的阳性反应,而从其他真菌和疫霉中反应管保持紫色的阴性反应。在灵敏度检测中,PL-LAMP技术最低检测限为100 pg.μLU1目标菌纯DNA。在对人工接种了大豆拟茎点种腐病菌的大豆植株发病组织的检测中,PL-LAMP技术能够检测出所有人工接种发病豆苗中的目标菌。在田间应用方面,对来自江苏、安徽和武汉的疑似发病的大豆样本进行检测。LAMP检测技术的阳性率为58/116(50.0%)、利用传统的病原分离法进行分离的阳性率为36/116(31.0%),结果显示,PL-LAMP技术明显的提高了检测效率。高通量检测是目前病原菌检测技术的发展方向,发展高通量的检测技术对于基层实验室和出入境口岸检疫具有重要的意义。对本论文关于我国口岸的两种植物检疫性病原物:大豆北方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.caulivora)、大豆南方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.meridionalis)的LAMP检测技术进行改良优化,连同南京农业大学吴旭东关于大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata f.sp.sojae)的LAMP检测技术,结合八连排反应管建立了一种能够同时检测一个样本中3种病原菌的高通量检测体系。在水浴锅内64℃扩增70 min,加入染料HNB(羟基萘酚蓝),作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果,如果存在目标菌,反应管颜色变为天蓝色,如果不含目标菌,反应液为紫色。应用该检测体系,对口岸截获来自3个不同国家的进口大豆残体进行带菌检测,结果显示,9份样品中检测到了 2份样品含有大豆北方茎溃疡病菌,1份样品中含有大豆茎褐腐病菌。本研究建立的高通量检测体系,具有快速、不需要特殊仪器和肉眼判断结果的优势,适合基层单位的实验室和检验检疫机构开展分子检测和病害诊断。综上所述,本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌,建立了一种快速、灵敏、特异、可视化的LAMP检测方法。LAMP检测方法在70 min内可完成待检样品检测过程,显著的缩短了检测时间,降低了基层部门的检测成本,其非常适合基层和出入境口岸等大批量样品的快速检测。同时基于以上的研究,本研究进一步建立了 LAMP技术和八连排反应管相结合的高通量检测技术体系,为多种不同检疫性病原菌的高通量检测提供了很好的技术平台。