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研究背景:随着社会环境的变化和人民生活水平的提高,人们饮食结构逐渐趋于高糖高脂等高能量饮食,造成高血糖高血脂人群不断增多,而不健康的饮食习惯也是肠道菌群失调的重要因素。2021年,2型糖尿病（type2 diabetesmellitus,T2DM）患病人数已高达5.37亿人,严重影响着人类身体健康和生命安全。T2DM发病机制主要以胰岛素抵抗（insulinresistance,IR）为主,伴以胰岛素相对或绝对分泌不足,但其具体机制尚不明确。近十年来,随着人们对肠道菌群的认识和深入研究,不断有研究证明肠道菌群与T2DM发生发展密切相关。胆汁酸（bile acid,BA）对脂肪和脂溶性维生素的吸收、转运和分配发挥着重要作用,也可作为一种信号分子调控法尼醇X受体（foresaid X receptor,FXR）和 G 蛋白偶联胆汁酸受体（takeda G protein binding bile acid receptor,TGR5）介导的信号通路,对调节体内能量代谢平衡和抑制肠道细菌过度增殖发挥着重要的生理功能。桑叶（Morus alba L.）是临床治疗糖尿病常用中草药,归肺、肝经。本课题组前期研究发现桑叶降糖调脂与抑制α-葡萄糖苷酶、调控Toll样受体（toll-likereceptors,TLRs）、胰岛素信号通路、调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/过氧化物酶体增殖物激活受体α/肉毒碱棕榈酰转移酶（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B/perixisome proliferation-activated receptor α/carnitine palmitoyl transferase-Ⅰ,PI3K/Akt/PPARα/CPT-1）信号通路、激活AMP依赖的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）信号通路以促进棕色脂肪组织（brown adipose tissue,BAT）和皮下腹股沟白色脂肪（inguinal white adipose tissue,IWAT）产热基因的表达等作用有关。随着研究的不断深入,在国家自然科学基金面上项目持续资助下,本课题深入探究桑叶总多糖治疗T2DM的作用及机制。桑叶总多糖是桑叶的主要活性成分之一,具有降血糖、抗炎、抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性和调节肠道菌群等作用。但桑叶总多糖对肠道菌群的调控机制尚不明确,有待更深入的研究分析。基于上述研究背景,本研究以桑叶总多糖为受试药,以T2DM大鼠为研究对象,基于肠道菌群-胆汁酸代谢探究桑叶总多糖治疗T2DM的作用及其机制,丰富桑叶总多糖治疗T2DM的理论依据,为桑叶总多糖防治T2DM提供新的科研思路与实验方法。研究方法:以SPF级雄性7-8周龄Sprague Dawley（SD）大鼠为受试对象,根据体重随机选取8只作为正常组（Z组）,采用高糖高脂饲料饲养四周联合腹腔注射35 mg/kg链脲佐菌素建立T2DM大鼠模型,以血糖≥ 11.1 mmol/L为成模标准,剔除不合格大鼠。按血糖和体重随机抽取32只T2DM大鼠建立伪无菌大鼠模型,方法如下:大鼠灌胃抗生素（50mg/kg万古霉素,100mg/kg硫酸新霉素,100mg/kg甲硝唑,100mg/kg氨苄西林）,1次/d,连续10d,以清除肠道菌群。造模组大鼠按血糖和体重随机分为模型组（M组）、阳性药二甲双胍组（Y组,200mg/kg）、桑叶总多糖低剂量组（SD组,100mg/kg）、桑叶总多糖中剂量组（SZ组,200mg/kg）、桑叶总多糖高剂量组（SG组,400mg/kg）、抗生素组（K组）、抗生素+桑叶总多糖低剂量组（KSD组,100 mg/kg）、抗生素+桑叶总多糖中剂量组（KSZ组,200 mg/kg）、抗生素+桑叶总多糖高剂量组（KSG组,400 mg/kg）。各组大鼠灌胃相应药物（1 mL/100g）,Z组、M组和K组灌胃等量蒸馏水,给药体积1 mL/100g。每日一次,给药10周。每周监测大鼠体重、血糖、进食量和饮水量。实验结束前进行口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test,OGTT）。实验结束,收集大鼠血清、肝脏、回肠组织。采用生化试剂盒测定血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白 胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C）含量;采用大鼠Elisa试剂盒测定血清总胆汁酸（totalbileacid,TBA）、胰高血糖素样肽-1（glucagon-likepeptide-1,GLP-1）、谷丙转氨酶（alanineaminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartateaminotransferase,AST）含量及粪便总胆汁酸含量。H＆E染色和油红O染色观察肝脏组织病理形态变化;16S rRNA高通量测序技术检测大鼠肠道菌群的丰富度、多样性和物种组成;qRT-PCR分析肝脏中胆固醇7α-羟化酶（Cyp7a1）和胆固醇12α-羟化酶（Cyp8b1）、和Fxr mRNA表达水平以及回肠组织中Fxr和Tgr5mRNA表达水平;Western blot检测肝脏中CYP7A1、CYP8B1、和FXR蛋白表达水平和回肠组织中FXR和TGR5蛋白表达水平。研究结果:（1）药效学实验结果表明,与M组比较,桑叶总多糖可以显著降低T2DM大鼠及伪无菌T2DM大鼠空腹血糖,改善OGTT,降低IR,减少进食饮水量,降低血清TC、TG和LDL-C含量,降低血清TBA、AST和ALT含量,增加粪便TBA含量。病理学结果显示,桑叶总多糖能明显改善M组和K组大鼠肝脏组织的空泡变性、炎细胞浸润病变,明显减少M组和K组大鼠肝脏内脂滴。血清TBA、AST和ALT,粪便TBA指标和肝脏切片结果共同提示了桑叶总多糖可以促进胆汁酸外排,有效降低肝脏的脂肪堆积,缓解肝损伤,具有一定保肝护肝作用。（2）16S rRNA测序结果显示,桑叶总多糖有效增加T2DM大鼠肠道菌群的丰富度、均匀度和多样性,增加优势菌群的OTUs数,恢复T2DM大鼠肠道菌群稳态。桑叶总多糖还可降低T2DM大鼠厚壁菌门/拟杆菌门比值,改善肠道菌群稳态,从而改善肥胖状态。同时,桑叶总多糖通过降低T2DM大鼠肠道致病菌克雷伯氏菌属和大肠杆菌-志贺氏菌丰度,增加有益菌普雷沃氏菌属、瘤胃球菌属、乳杆菌属丰度,有效调节了肠道菌群组成,改善了 T2DM引起的肠道菌群紊乱状态。（3）机制研究实验结果显示,桑叶总多糖能促进T2DM大鼠肝脏Cyp7a1、Cyp8b1和回肠Tgr5 mRNA表达,抑制T2DM大鼠肝脏和回肠中FxrmRNA表达,上调T2DM大鼠肝脏CYP7A1、CYP8B1和回肠TGR5蛋白水平,抑制T2DM大鼠肝脏和回肠FXR蛋白水平。肠道菌群和血清指标相关性分析结果显示,在门水平上,厚壁菌门丰度与AST、ALT、TBA、LDL-C、HDL-C 成负相关,拟杆菌门丰度与 TC、TG、LDL-C、AST、ALT、TBA成负相关,含较多致病菌的变形菌门丰度与AST、ALT、TBA呈正相关。在属水平上,致病菌克雷伯氏菌属与TC、LDL-C、AST、ALT、TBA成正相关,瘤胃球菌属、普雷沃氏菌属与TC、TG、LDL-C、AST、ALT、TBA成负相关,乳杆菌属与TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、TBA 成负相关。研究结论:桑叶总多糖可降低T2DM大鼠空腹血糖和血脂水平,改善糖脂代谢紊乱和IR;增加普雷沃氏菌属、瘤胃球菌属、乳杆菌属丰度,改善大鼠肠道菌群紊乱;调节胆汁酸代谢,减少机体的胆固醇水平;其机制与抑制肝脏和肠道FXR通路以及激活肠道TGR5-GLP-1信号通路有关。