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硒(Selenium,Se)是机体内不可或缺的必需微量元素。通常,硒在膳食中以各种形式存在,被机体摄取以后,在细胞内活化成硒酸,进而通过共翻译机制合成硒代半胱氨酸,随后整合至肽链,并入硒蛋白后在机体发挥生物学作用。所有含硒代半胱氨酸的蛋白质被称为硒蛋白(Selenoprotein,Sel),目前已知的硒蛋白家族有30种,其中鱼类最多,有30种,啮齿类24种,人类基因组中有25种硒蛋白,包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPx1-4,而GPx6仅在人类基因中含硒)、硫氧还蛋白还原酶(Trx R1-3)、脱碘酶(DIO1-3)、磷酸硒合成酶2(SPS2)、Sep 15、Sel H、Sel I、Sel K、Sel M、Sel N、Sel O、Sel P、Sel R、Sel S、Sel T、Sel V、Sel W等。而其中大部分功能已有所了解,都参加细胞内氧化还原酶反应,而硒蛋白O(Sel O)作为哺乳动物体内最大的硒蛋白,其功能及其确切作用机制尚不完全清楚。同时Sel O作为人类基因组计划执行以来,少数功能未知的蛋白之一,其功能也值得探究。硒与硒蛋白与人类健康息息相关,有研究发现在中国硒缺乏地带会出现骨发育障碍疾病,因此硒缺乏可能是软骨发育障碍的一个可能致病因素。因此,本研究旨在观察Sel O在软骨发育过程中的作用及其分子作用机制。首先,我们观察了Sel O在软骨组织中的表达,通过HE染色和免疫组化试验发现,Sel O在生长板软骨组织中的肥大区高度表达。另外在细胞层面,我们诱导成软骨细胞分化,并收集分化不同时间点的细胞总蛋白,通过WB试验检测Sel O的表达;结果显示Sel O在成软骨细胞诱导分化过程中持续表达。以上两部分试验证明,Sel O在软骨组织有表达。其次,我们设计干扰试验干扰Sel O的表达,观察Sel O在软骨发育中的作用。在软骨组织层面,我们对小鼠胫骨进行离体培养,通过慢病毒干扰Sel O在胫骨中的表达,结果显示,干扰Sel O会导致小鼠胫骨发育不良,生长板结构异常;随后通过阿辛蓝和稀素红分别对胫骨中软骨和骨的部分进行染色后发现,干扰Sel O主要是抑制的胫骨组织中生长板软骨部分的发育障碍,进一步对生长板软骨进行HE染色发现,干扰Sel O会抑制生长板软骨中静息区、增殖区、前肥大区、肥大区各部分组织生长,同时还导致肥大区结构异常。而在细胞层面,我们通过微团培养软骨细胞分化模型,通过Sel O特异性靶sh RNA干扰Sel O表达后发现,干扰Sel O会导致软骨细胞基质中标记软骨形成的蛋白聚糖(GAGs)的积累减少,碱性磷酸酶(ALP)的活性显著降低。而另外我们收集细胞总蛋白通过WB试验发现,干扰Sel O会抑制软骨形成的标志基因Sox9,Col II和软骨聚糖蛋白Aggrecan的表达,以上结果证明:干扰Sel O表达后,抑制了软骨细胞的分化,导致软骨组织中各区域的生长减缓,进而导致软骨发育不良,胫骨生长障碍。而细胞分化是以细胞增殖为基础,所以我们又进一步通过MTT比色法测定细胞活力,发现干扰Sel O,细胞活力明显下降。而细胞增殖是影响细胞活力的重要因素,因此,我们通过细胞流式技术分析了细胞周期进程,发现干扰Sel O会导致细胞G0/G1明显增多,细胞周期延长。同时WB试验结果证明,干扰Sel O会导致细胞周期蛋白Cycin D1表达降低,两部分试验结果证明:干扰Sel O导致细胞周期进程延缓,进而抑制了软骨细胞增殖。另外,细胞活力的降低也有细胞死亡的因素,所以我们进一步通过LDH细胞毒性检测细胞的死亡,发现干扰Sel O后软骨细胞死亡明显增多。进一步的Annexin V-PI双标记染色法结果证明,干扰Sel O后,细胞凋亡增加。同时WB试验结果证明,干扰Sel O后Caspase-3活化增加,Caspase-3凋亡通路活化。试验结果显示干扰Sel O后能够诱导细胞凋亡进而导致软骨细胞死亡,从而使得细胞活力降低。最后,明确Sel O在软骨分化发育中的重要作用之后,我们进一步探究Sel O发挥作用的分子机制。结合已知的硒蛋白大都参与细胞氧化还原酶反应这一特点,我们通过H2O2诱导细胞氧化应激后,发现干扰Sel O后软骨细胞对氧化应激并无明显反应,相反,软骨细胞内抗氧化酶GPX活力还增加,ATP合成含量增加。说明:Sel O对软骨细胞内氧化还原调节不明显。介于此,我们又通过软骨形成过程中,需要分泌大量胞外基质,细胞分泌途径活跃的特性,观察Sel O是否参与内质网稳态调节。首先,我们对细胞进行亚细胞组分分离,通过WB试验,比对细胞胞质蛋白GAPDH和线粒体蛋白VDAC1和Sel O的亚细胞分布,结果表明:Sel O并未在线粒体中富集。同时,我们又收集细胞总蛋白和总RNA,通过WB试验和Q-PCR试验发现,干扰Sel O会导致内质网应激的标志因子,ATF6、CHOP、Xbp-1s的活化增加,显示干扰Sel O会导致内质网应激,Sel O参与内质网稳态的调节。总之,本文揭示了Sel O在软骨发育与软骨细胞分化过程中表达、观察了Sel O对生长板软骨生长的影响、明确了Sel O对成软骨细胞分化过程中软骨细胞增殖与死亡等不同分化阶段的选择性作用、及Sel O通过调控内质网途径进而影响软骨细胞分化的可能机制。