核酸检测是分子诊断的主要手段之一,在卫生保健、环境监测、生物安全以及食品分析等许多领域发挥了重要的作用,开发操作简单成本低的高灵敏度、高特异性核酸检测技术具有重要意义。近年来,基于CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system）系统发展的一系列高灵敏度和高专一性的核酸检测技术在临床诊断上取得了显著的进展,然而Cas效应蛋白需要使用RNA作为向导,并且依赖特殊序列,比如PAM（Protospacer adjacent motif）或者PFS（Protospacer flanking site）,来识别靶位点,这在一定程度上限制了其应用。与Cas效应蛋白类似,Argonaute（Ago）也是一类以核酸作为向导的核酸内切酶。PfAgo（Pyrococcus furiosus Argonaute）是一种来源于古生菌的原核Ago蛋白质,可以利用具有5’磷酸基团的单链DNA（大于15 nt）作为向导,从向导的5’端开始的第10和11个核苷酸之间的位点切割互补的单链DNA。本研究发现PfAgo切割产生的单链DNA能够作为向导引发新的酶切反应。基于此发现,我们建立了一种具有高灵敏度、高特异性和多重检测能力的核酸检测方法,通过对临床核酸样本的检测证明了该方法的可行性和应用潜力。随后,我们将该方法加以改进并用于SARS-CoV-2的核酸检测。同时,本研究利用向导的长度对PfAgo切割活性的影响,将极短PCR技术与PfAgo结合起来开发了另一种简单快速的核酸检测方法。综上,本研究通过深入探究PfAgo的酶学性质开发了三种高灵敏度、高特异性、高准确性的核酸检测技术,为分子诊断提供了新的方法选择,并为Ago蛋白的应用提供了新的思路。本论文的具体内容如下:1.PfAgo蛋白质的表达纯化及性质研究。根据PfAgo耐高温的性质,利用80°C水浴处理和Ni-NTA亲和纯化获得了高纯度PfAgo蛋白质。对PfAgo性质的进一步研究发现向导DNA（guide DNA,g DNA）与靶DNA（target DNA,t DNA）的单碱基不匹配会显著影响PfAgo对靶的切割效率。此外,g DNA 3’端的突出对PfAgo的切割活性没有影响,5’端突出会影响PfAgo的切割活性和切割位点。本研究发现PfAgo切割单链DNA产生的具有5’磷酸基团的单链DNA可以作为新的g DNA介导PfAgo靶向切割与之互补的单链DNA,表明PfAgo的切割反应可以传递。2.结合PfAgo切割反应可传递的特点和PCR技术开发基于PfAgo的核酸检测方法（PAND）。设计三条分别靶向待检测双链DNA不同位置的g DNAs（输入g DNAs）介导PfAgo切割双链DNA靶,并从中释放出一条单链DNA,作为新的g DNA（生成g DNA）与PfAgo蛋白结合,靶向切割互补的分子信标,从而产生荧光信号,实现检测的目的。该方法检测灵敏度可以达到1.6 a M、能够识别单碱基突变和实现五通道检测。对模拟样本和临床样本的检测结果表明该方法可以应用于16S r DNA、结核杆菌和乙肝病毒耐药性突变、BRAC1基因的单核苷酸位点多态性位点、循环肿瘤DNA以及人乳头瘤病毒（HPV）多亚型分型的检测。3.结合逆转录PCR技术和PfAgo切割反应开发了基于PfAgo的SARS-CoV-2检测（SARS-CoV-2 PAND）。通过筛选最佳的PfAgo/g DNA复合物,仅利用单条输入g DNA建立了高灵敏度、高专一性、高准确度的SARS-CoV-2核酸诊断方法,检测下限可以达到1拷贝每反应。该方法缩短了荧光定量PCR仪的使用时间,能够有效解决大规模检测时荧光定量PCR仪不足的问题。对44例新冠病毒疑似感染者的咽拭子核酸提取物的检测结果与荧光定量逆转录PCR（RT-q PCR）一致,同时对36例阳性样品进行了D614G突变检测,证明SARS-CoV-2 PAND可以用于SARS-CoV-2及其突变体的检测。4.基于PfAgo的切割活性只能由长度大于15 nt的g DNA触发的性质开发了结合极短PCR技术和PfAgo的核酸检测方法（USPCRP）。利用具有5’磷酸基团的短引物启动的极短PCR的扩增产物作为g DNA来介导PfAgo切割分子信标,进行DNA检测,该方法无需额外加入g DNA,具有100 a M的检测灵敏度和序列特异性。利用该方法成功对临床样本的HPV16E6基因和SARS-CoV-2 ORF1ab基因进行了检测,表明该方法能够用于临床诊断。