论文部分内容阅读
背景 树突状细胞(DCs)是体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APCs),直接调节机体免疫应答和免疫耐受之间的平衡。DCs的双向调节功能与其自身发育的不同阶段密切相关,同时DCs的分化成熟又与其表面FcgR表达密不可分。前期研究发现DCs及其前体细胞表面的激活型和抑制型FcγR参与调控细胞的分化成熟和免疫学功能。FcγR参与DCs分化、成熟以及免疫效应主要由其自身激活型基序(ITAM)和抑制型基序(ITIM)所决定的。基质交感分子-1(STIM1)是近年发现的Ca2+通道调节蛋白,堪称细胞内质网上侦测钙离子含量的感应器(sensor),是“填充式Ca2+涌入理论”(capacitative calcium influx)体系中的重要分子,具有潜在的有效调节DCs免疫功能的作用。基质交感分子-2(STIM2)是调控基础Ca2+流入的主要分子,在Ca2+通道应答的后期阶段扮演重要角色。细胞Ca2+的流动不但参与调节T、B等免疫细胞的功能,同时也是细胞表面免疫受体胞内共有的ITAM和ITIM发挥激活和抑制功能的主要元素。由于FcgRs发挥功能是通过胞内ITAM和ITIM引起Ca2+的流动实现,而Ca2+的流动本身可能是影响DCs分化成熟的重要环节。因此,探索STIM1和STIM2在FcgRs调控DCs分化成熟中的作用对阐明DCs的免疫调节机制,发掘DCs调控免疫反应的靶点有重要的科学意义。 目的: 通过探讨STIM1及STIM2在FcgR调控树突状细胞成熟中的作用,阐明STIM1和STIM2在DCs发挥免疫调节中的作用。 方法: 1.DCs体外培养体系的建立 采用密度梯度离心法,分离人外周血单个核细胞(PBMC)利用单核细胞贴壁特性,获取单核细胞。采用重组人白细胞介素-4(rhIL-4)100ng/mL联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)100ng/mL刺激6天收获未成熟DCs(iDCs);第6天加入脂多糖(LPS)1μg/mL刺激24h后收获成熟DCs(mDCs)。采用倒置相差显微镜观察DCs形态学变化,流式细胞仪鉴定DCs表型。 2.激活FcgR受体对STIM1和STIM2表达的影响 流式细胞仪和免疫荧光检测DCs表面激活型受体FcγRIIa和抑制型受体FcγRIIb的表达;Real-time PCR和Western-Bolt检测iDCs和mDCs中STIM1和STIM2的表达差异;分别采用IV.3和7.3与 F(ab’)2结合形成免疫复合物,分别交联DCs表面激活型和抑制型FcγR后,使用Real-time PCR和Western-Bolt检测交联3min和30min后,细胞内 STIM1和STIM2的表达差异。 3.STIM1和STIM2的RNA干扰体系建立及鉴定 采用化学法合成siRNA,通过Lipo化学转染法递送siRNA进入DCs,采用Real-time PCR技术检测转染效果,MTT法检测转染24h后细胞活性。 4.调节STIM1和STIM2的表达对DCs成熟的影响 采用siRNA技术分别沉默DCs中STIM1和STIM2的表达,流式细胞仪检测DCs表型。 结果: 1.iDCs高表达抑制型受体FcγRIIb(MFI,1572±114.6),LPS诱DCs成熟后 FcγRIIb中度降低(MFI,900±21),激活型受体 FcγRIIa表达未见明显变化(MFI,740±51)。 2.DCs高表达STIM2,而DCs成熟后STIM1的表达明显增高(P<0.05)。采用siRNA干扰技术可以有效抑制STIM1和STIM2的表达,其抑制率分别为70.1％和65.8％,且对DCs活性无明显影响, DCs存活率分别为(94.17±12.38)％和(99.17±5.07)％。沉默DCs内STIM1和STIM2,DCs的成熟状态未见明显变化(P>0.05),仍高表达CD80、CD86、HLA-DR、CD40、CD83。 3.交联DCs表面激活型和抑制型FcγR3min后,STIM1和STIM2未见明显变化,与对照组相比,STIM2 mRNA的表达明显降低,然而交联抑制型受体FcγRIIb30min后,STIM1和STIM2表达明显增高(P<0.01),交联 FcγRIIa后,STIM1和STIM2表达明显降低(P<0.01)。 结论: 1.DCs同时表达STIM1和STIM2两种蛋白,且主要表达STIM2, STIM1随DCs成熟表达量明显增加; 2.抑制STIM1和STIM2两种蛋白的表达,DCs仍可被诱导成熟; 3.STIM1和STIM2共同调控FcgR信号通路,且二者高表达可能诱导DCs致耐受。