支原体导致的猪支原体肺炎、鸡毒支原体病、牛传染性胸膜肺炎和山羊传染性胸膜肺炎给养殖业带来严重的经济损失。由于目前支原体疫苗的免疫接种效果欠佳,兽医临床常用的泰乐菌素等抗菌药物耐药性严重和药物残留问题被普遍关注,急需开发廉价、高效、广谱、无毒的中药复方抗畜禽支原体制剂。为进一步研制抗畜禽支原体中药复方,本课题在前期工作基础上选取南药两面针、广藿香、南板蓝根、黄连、黄芩、黄柏、甘草、白鲜皮、土槿皮、艾叶等10味中药,通过体外微量药敏试验,结合中兽医理论基础和中药药剂学理论,筛选出有效的抗畜禽支原体单味中药及最佳中药复方,通过药效学试验评价最佳中药复方的安全性和临床疗效,并将其制成中药复方颗粒剂,同时对该复方颗粒剂进行质量标准、初步稳定性及其化学成分研究。具体研究方法与结果如下。1抗畜禽支原体中药复方肺康明确立采用水回流提取法和微量液体稀释法,对两面针、广藿香、南板蓝根、黄连、黄芩、黄柏、甘草、白鲜皮、土槿皮、艾叶等10味中药进行体外抗畜禽支原体研究。结果表明10味中药中,除了广藿香、土槿皮和艾叶外,其余7味中药对3种畜禽支原体均具有不同程度的体外抑制和杀灭作用；对照药物酒石酸泰乐菌素对试验用3种畜禽支原体均具有较高的敏感性。对有效的抗畜禽支原体单味中药进行两两联合药物敏感性试验,结果表明7味中药水提液两两配伍组合,对牛支原体、鸡毒支原体和羊肺炎支原体的抑制效果表明两面针、南板蓝根、黄连、黄芩、黄柏、甘草、白鲜皮间均无拮抗作用,宜配伍。在中医理论的指导下,根据中医方剂组成原则及配伍规律,自拟7组中药复方,通过药敏试验研究表明原复方和7组中药复方均具有不同程度的抗畜禽支原体活性,其中复方5(南板蓝根、两面针、白鲜皮)作用最好,且药味较少,故选用复方5作为抗畜禽支原体最佳中药复方,命名为肺康明。2中药复方肺康明药效学研究对健康雏鸡进行临床用药安全性研究,结果表明中药复方肺康明以16g生药/d兑水饮用5d,鸡只内脏各器官无任何异常,提示该方此剂量对鸡安全。采用1×109CCU/mL的MG培养物通过鸡胸气囊接种0.5mL、滴鼻0.3mL、点眼0.2mL,以及创造应激条件建立人工感染鸡毒支原体鸡只模型,并通过临床症状、病理观察、分离培养、鉴定及血清学诊断,证实了该疾病模型建立成功。临床药效试验结果表明肺康明高、中剂量组治疗MG人工感染病鸡疗效显著。死亡率方面,与感染对照组比较,各用药组均有不同程度的下降；肺康明高、中剂量和酒石酸泰乐菌素组死亡率均为0%,肺康明低剂量组和预防组死亡率很低,分别为5.00%、2.50%。治愈率方面,肺康明高剂量组疗效最好(92.5%),明显优于低剂量组,中剂量组与对照药物酒石酸泰乐菌素组具有相同的疗效(90%)；增重方面,各用药组均显著高于感染对照组,但低于正常对照组,而肺康明高剂量组与正常对照组相当；料肉比方面,酒石酸泰乐菌素组最低,其他各用药组与健康组相当,感染对照组最高；血清抗体水平方面,各用药组均能明显减少抗体阳性反应数,其中肺康明高剂量组效果最佳；气囊损伤方面,各用药组气囊病变较感染对照组轻,其中肺康明高剂量组效果最好,其次为复方肺康明中剂量组和酒石酸泰乐菌素组。提示本复方对MG感染具有良好的治疗效果,并克服抗生素类药物长期使用会产生耐药性的缺点,可用于本病的防治。推荐肺康明用于MG鸡只的治疗量为0.4%兑水饮用给药浓度,预防量为0.2%兑水饮用给药浓度,连续用药5d,每天配换一次药液。3中药复方肺康明颗粒剂制备工艺研究根据临床需要、预试验结果、生产条件及技术水平,选择剂型为颗粒剂。本试验主要以多成分多指标综合评价,采用正交试验设计和单因素考察法进行最佳制备工艺筛选,最终确定中药复方肺康明颗粒剂的制备工艺为：取处方比例南板蓝根、两面针、白鲜皮粗粉(10目),精密称定,加入12倍量的水,浸泡0.5h,回流提取3次,每次1.5h,合并3次提取液,超速离心(8000r/min,15min)后,真空减压(温度60℃,真空度0.08～0.10MPaa,蒸汽压力≤0.10MPa)浓缩至相对密度为1.10(60℃)的流浸膏；取该流浸膏进行喷雾干燥,物料温度：50～60℃,进液速度：50～60mL/min,进风温度：165～170℃,出风温度：70～75℃,收集干燥浸膏粉,按干浸膏粉：糊精=1：0.6混匀,过80目筛,采用干式制粒法,设定轧辊压力为60～70kgf/cm2,轧辊转速为12～14r/min,送粉速度为14～16r/min制成颗粒1200g,过筛,分装,即得。同时经三批中试试制证明,拟定工艺简单合理、稳定可行,可满足工业化大生产的要求。4中药复方肺康明颗粒剂质量标准及初步稳定性研究质量标准研究方面,主要进行原料药材及辅料质量标准和颗粒剂质量标准研究。原料药材及辅料质量标准中主要对投料药材饮片按照《中华人民共和国药典》2010年版(一部)相关项下规定进行检查；辅料—糊精按照《中华人民共和国药典》2010年版(二部)相关项下规定进行检查。颗粒剂质量标准中对中试生产的三批样品进行鉴别、检查和含量测定研究。对方中各味药均进行了薄层色谱鉴别试验,并将南板蓝根、两面针、白鲜皮的薄层色谱鉴别列入本品质量标准正文。检查项下,对粒度、水分、溶化性、装量差异、重金属、砷盐、微生物限度等进行检查均符合《中国药典》2010年版一部附录制剂通则I C颗粒剂项下有关规定,并将其列入本品质量标准正文。采用高效液相色谱法对主要有效成分靛蓝、氯化两面针碱和白鲜碱进行含量测定,并进行了系统方法学考察,均符合要求,并将含量测定列入本品质量标准正文,根据多批样品测定结果,制定了主要有效成分的含量限度,暂定本品每袋(5.0g)含南板蓝根以靛蓝计,不得低于773.08μg；两面针以氯化两面针碱计,不得低于846.84μg；白鲜皮以白鲜碱计,不得低于3301.67μg。初步稳定性研究方面,加速稳定性试验结果表明样品采用铝塑复合膜袋为包装材料在考察期内其性状、鉴别、检查等各项考察指标均符合本品质量标准草案规定,提示本品在高温高湿条件下贮存6个月,可保证质量稳定。长期稳定试验结果表明9个月的考察期内其性状、鉴别、检查等各项考察指标均符合本品质量标准的规定,提示本品在常温条件下保存9个月,可保证质量稳定；试验结束时间为24月末,其后续工作仍在进行当中。5中药复方肺康明化学成分研究按处方量的200倍称取南板蓝根、两面针、白鲜皮粗粉,以水回流提取,提取液经减压浓缩和喷雾干燥后,依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行部位分离后,采用反复硅胶柱色谱及重结晶等方法进行系统的化学成分分离与纯化,并根据理化常数测定和光谱测定(EI-MS或EIS-MS、1H-NMR、13C-NMR、Dept等)所得数据以及文献对照确定了21单体化合物的结构,分别为：氯化两面针碱(nitidine chloride,1),大黄酚(chrysophanic acid,2),熊果酸(ursolic acid,3),靛蓝(indigotin,4),靛玉红(indirubin,5),硬脂酸(stearic acid,6),辛夷脂素(fargesin,7),补骨脂内酯(psoralen,8),木犀草素(luteolin,9),香草醛(vanillin,10),棕榈酸(palmitic acid,11),大黄素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷(emodin-8-O-β-D-glucopyranoside,12),槲皮苷(quercetin-3-rhamnoside,13),棒酮(fraxinellone,14),黄柏酮(obacunone,15),柠檬酸(citric acid,16),白屈菜碱(chelidonine,17),腺苷(adenosine,18),胞苷(cytidine,20),黄芩苷(baicah,20),苯甲酸(benzoicacid,21)。其中化合物3、7、10-13、16-17、19～21均首次在组成肺康明的3味中药南板蓝根、两面针和白鲜皮中发现。综上所述,本课题通过体外抑菌试验对10味中药进行筛选,确定了最佳中药复方,命名肺康明,对MG感染具有良好的治疗效果,使用安全。对该方进行颗粒剂制备工艺研究,其工艺简单合理、稳定可行,可满足工业化大生产的要求。其制剂基本稳定,安全性高,质量标准稳定、可控。同时从该方氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物中共分离鉴定了21个化合物,其中11个化合物均首次在组成中药复方肺康明的3味中药南板蓝根、两面针和白鲜皮中分得。本课题为新兽药的研发及广泛应用中药防治临床畜禽支原体病提供了科学依据。