花刺参(Stichopus herrmanni)多糖的结构特征与药理活性研究

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海洋棘皮动物海参体壁含有化学结构特殊且药理学活性显著的多糖类成分。  本课题组前期在花刺参所含岩藻糖化糖胺聚糖SvFG的纯化寡糖研究方面取得积极进展。在此基础上,为全面了解和花刺参体壁所含多糖的种类及潜在应用价值,本文对花刺参体壁来源的总多糖进行了系统的分析研究,对其所含不同类型的多糖进行了系统的分离纯化,并对其基本结构和理化性质进行分析研究。本文在比较分析花刺参来源的岩藻糖化糖胺聚糖(SvFG)和岩藻聚糖硫酸酯(SvFS)的抗凝活性及特征的基础上,重点分析研究了新获取的SvFS的抗凝药理机制及构效关系。鉴于纯化寡糖在阐明SvFG的确切结构研究中的作用,以及天然来源的岩藻聚糖硫酸酯的确切结构研究相对有限,本文重点探讨了SvFS解聚与纯化寡糖制备,尝试通过纯化寡糖的结构分析阐明天然岩藻聚糖硫酸酯的确切结构特征。  总体上,本文的主要研究成果包括:  (1)花刺参体壁多糖分离纯化与理化性质分析以酶解-碱解联用的方法提取花刺参多糖,采用KOAc-乙醇分级醇沉结合强阴离子交换树脂FPA98进一步纯化,获得了均一性良好的SvFG和SvFS,其纯度均大于95%,理化性质及单糖组成分析结果显示,SvFG为岩藻糖化糖胺聚糖,SvFS为岩藻聚糖硫酸酯。  (2)花刺参多糖的基本结构解析SvFG解聚产物dSvFG(5.66kDa)的1D/2DNMR谱图分析结果表明,其基本结构为:{-4)-[L-Fuc2S4S-(α1-3)-]-D-GlcA-(β1-3)-D-GalNAc4S6S-(β1-}n,其所含侧链Fuc类型主要为Fuc2S4S,还有少量的Fuc4S和Fuc3S4S存在。SvFS的解聚产物dSvFS4的1D/2D NMR谱图分析结果表明,SvFS是结构相对规则的岩藻聚糖硫酸酯,其基本结构为{-3)-L-Fuc2S-(α1-}n,是化学结构新颖的天然岩藻聚糖。  (3)SvFS的纯化寡糖制备与确切结构解析  过氧化氢解聚法制备SvFS的纯化寡糖,获得两种寡糖组分FⅠ和FⅡ,结构分别为L-Fuc2S-(α1-3)-BDA2S和L-Fuc2S-(α1-3)-L-Fuc2S-(α1-3)-BDA2S。两种寡糖的糖基组成与原型SvFS结构相符,而还原端所含有丁二酸衍生物片段提示过氧化氢解聚涉及糖苷键的氧化裂解以及还原端糖环的进一步氧化。  三氟乙酸解聚法制备SvFS的纯化寡糖,获得五种寡糖化合物。化合物1、3、5结构与SvFS结构相同,而化合物2和4还原端硫酸酯基水解,说明本文酸水解的条件可使SvFS的硫酸酯基部分脱落。系列寡糖化合物1-5的结构解析显示,SvFS主要是由Fuc2S通过α-1,3糖苷键连接的线性大分子岩藻聚糖,但含有少量的Fuc4S及Fuc2S4S,表明其化学结构仍然存在一定的不规则性。  (4)SvFS的药理学活性分析SvFG和SvFS对内源性凝血途径有影响;SvFG具有强效的FXase抑制活性,而SvFS的作用靶点主要为Ⅱa和内源性FXase,其FXase抑制活性随着分子量的减小明显减弱;SvFS依赖HCⅡ的抗Ⅱa活性,随着分子量减小,呈现先增强后减弱的趋势,其中分子量20kDa左右时活性最强,这一研究结果可为选择性依赖HCⅡ的Ⅱa的抑制剂的研究提供学术依据。小鼠凝血酶致死实验的结果表明,dSvFS280mg/kg组和40mg/kg组的死亡率分别为50%和67%,说明dSvFS2可能具有体内抗凝血酶的药理活性。  本文相对系统地研究了花刺参体壁的两种多糖组分,包括SvFG和SvFS。与其它海参来源的同类型多糖相比,SvFG、SvFS具有结构相对规则和简单的特点,其中SvFS是化学结构新颖的天然岩藻聚糖。  本文首次报道了天然SvFS来源的纯化寡糖,并通过波谱法解析了这些纯化寡糖的确切结构。通过纯化寡糖的结构研究可见,SvFS的基本结构相对规则,但其硫酸酯基取代类型还存在一定的不规则性,即,除Fuc2S外,SvFS还含有少量不规则排列的Fuc4S及Fuc2S4S。  活性研究显示,SvFG、SvFS均具有抗凝活性,SvFG强效抑制FXase,而适当解聚的SvFS则主要存在HCⅡ依赖的Ⅱa抑制活性。
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