研究背景：随着肥胖和代谢综合征在全球流行,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)增长迅速,在我国已成为仅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病,在西方发达国家是慢性肝病的首要病因,影响了1/3的成年人和越来越多的儿童。近20年来NAFLD已成为临床密切监测和研究的目标。目前西方国家NAFLD患病率约20-30%,亚太地区约12～24%。据调查,我国成人中的NAFLD发病率为15%,儿童2.6%-9.6%,而肥胖儿童的发病情况上升至38%-58%。NAFLD与2型糖尿病(T2DM)关系密切,调查显示NAFLD易发展为糖耐量异常(IGT)甚至T2DM,NAFLD的T2DM发病率比普通人群高3.8-11倍；而T2DM的NAFLD发病率达34%-74%,特别是伴有肥胖的T2DM,NAFLD发病率几乎为100%。临床合并NALFD的T2DM,血糖控制难度增加,并发心血管疾病、糖尿病肾病的风险增加。以上资料提示,我们对诊断为NAFLD的人群需要给予一定干预来防止疾病继续进展,这样做不仅能保护肝脏也能减少T2DM的发生；我们在强调早发现、早治疗T2DM的同时,需要关注肝脏的状况,对合并有NAFLD的T2DM人群更需要积极治疗脂肪肝。NAFLD指除外酒精及其他明确肝损伤因素,由遗传-环境-代谢应激相关因素联合所致的脂质特别是甘油三酯在肝细胞沉积,导致弥漫性肝细胞脂肪变性为主要特征的临床病理综合征。过去较长的时间里,对NAFLD的研究都局限在肝脏本身,认为其仅仅是一个局限在肝脏的疾病,但随着研究的深入,发现其与多项代谢指标(血糖、血脂、肥胖等)关系密切,越来越多的学者主张将NAFLD视为代谢综合佂(MS)的组分之一。NAFLD的发病机制至今仍未完全阐明,目前被广泛接受的是Day等的“二次打击学说”,具体内容是指：“第一次打击”主要是胰岛素抵抗(IR)和高胰岛素血症,导致良性的肝细胞脂质沉积；“第二次打击”为各种致病因素引发的氧化应激状态使反应性氧化物(ROS)增多,导致脂质过氧化伴线粒体损伤及解偶联蛋白(UPCs)等细胞因子活化,导致肝细胞发生炎症、坏死,甚至进展为肝纤维化。IR和氧化应激失衡与NALFD及T2DM都有着非常密切的关系。IR是NAFLD及T2DM发生的重要原因,在多基因遗传因素及环境因素(如摄食过多、热量过剩等)的作用下,靶器官(肝脏、脂肪等)对胰岛素作用的敏感性降低,形成IR,促使外周脂肪分解增加和高胰素血症,引起肝细胞脂质蓄积、诱导肝细胞对内外源性损害因子(如FFA、TNF-a、瘦素等)敏感性增高,进一步抑制胰岛素的信号转导,减少胰岛素的清除,加重IR,从而形成IR和NAFLD之间的恶性循环。氧化应激失衡是NAFLD进展的催化剂,在生理状态下,葡萄糖通过糖酵解、FFA通过β氧化途径,最后进入三羧酸循环产生电子供体NADH和FADH2,NADH和FADH2的H通过呼吸链与氧结合成水,而它们提供的电子能量,其中一部分用于合成ATP,一部分通过解偶联蛋白(UCPs)产生热能。但当NADH和FADH2过多时,有过多的电子供体,就会把电子传给氧,从而形成ROS。NAFLD及T2DM具有高血糖、高FFA的病理内环境,通过线粒体氧化产生更多的ROS,有研究认为,T2DM是脂肪肝向脂肪性肝硬化发展的独立危险因素。对于NAFLD合并T2DM患者来说,在良好降糖的同时能兼顾改善脂肪肝的降糖药物才是治疗首选。近年来新型降糖药GLP-1类似物和DPP-4抑制剂在临床应用中降糖疗效及安全性得到认可,在降糖药物中的地位正不断提升,在最近ACCE糖尿病指南中,已将其列为紧随二甲双胍之后的降糖药物。从关于利拉鲁肽的全球Ⅲ期临床研究LEAD系列研究看,其中纳入了数千名合并有NAFLD的T2DM患者,使用利拉鲁肽治疗半年后肝功能好转、影像学检查见肝内脂肪含量减少,肝组织的炎症评分减低。近期陆续有关于艾塞那肽的基础研究报道其通过影响胰岛素信号通路及氧化应激相关蛋白酶的表达,调节胰岛素抵抗状态及氧化应激状态,影响肝内脂肪的变化。DPP-4抑制剂及GLP-1类似物同属于肠促胰素类药物,从GLP-1类似物改善NAFLD的疗效中似乎看到了DPP-4抑制剂同样具有类似的超越降糖作用的曙光。早前研究提示肝细胞上有DPP-4蛋白的表达,且DPP-4活性和表达强度与肝组织病理分级和肝细胞脂肪变性程度相关。关于DPP-4抑制剂西格列汀临床报道称,合并有NAFLD的T2DM患者使用西格列汀干预后不仅血糖得到改善,肝功能也好转。但鉴于现有研究数量仍不多,其疗效及作用机制仍需要继续探讨。因此本实验将观察沙格列汀对NAFLD合并T2DM大鼠模型的治疗效果,并围绕“二次打击学说”相关方面探讨其改善脂肪肝可能的作用机制。第一部分探讨沙格列汀对高糖高脂饮食联合小剂量STZ诱导的非酒精性脂肪肝合并2型糖尿病大鼠模型的干预效果目的：评估沙格列汀对非酒精性脂肪肝的干预疗效方法：(1)动物模型的构造：高糖高脂饲料喂养8周后抽签法随机处死两只大鼠用于检测血糖、胰岛素、肝功能、血脂及肝脏病理,观察胰岛素抵抗状态、肝功能及血脂的异常情况、肝组织脂肪变性情况判断NAFLD模型成功与否；给予小剂量链脲佐菌素(STZ)(30mg／kg)进行T2DM造模；(2)实验分组与处理：实验动物分为3组,A组为正常对照组,一直给予标准饲料喂养,给予生理盐水灌胃对照；B组为模型对照组,一直给予高糖高脂饲料喂养,小剂量STZ造成NAFLD合并T2DM模型后,给予生理盐水灌胃对照；C组为沙格列汀干预组,一直给予高糖高脂饲料喂养,小剂量STZ造成NAFLD合并T2DM模型后,给予2mg/ml沙格列汀溶液l0mg/kg/d灌胃。(3)检测生化指标：全自动生化仪检测血清血糖、甘油三酯、总胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶；放射免疫法检测血清胰岛素。计算胰岛素抵抗指数及胰岛素敏感指数。(4)检测肝组织病理：HE染色及油红0染色观察肝组织病理情况。结果：(1)动物模型成功率通过高糖高脂饮食及小剂量STZ方案构造NAFLD合并T2DM动物模型成模率高达80%。(2)实验结束各组生化指标的情况与正常对照组比,模型对照组血糖、胰岛素、HOMA-IR、血脂、肝功能均明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比,沙格列汀干预组血糖、胰岛素、HOMA-IR、肝功能、肝质量、肝指数均降低,且差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比,沙格列汀干预组体质量、血脂略有降低,但差异不显著(P>0.05)；与正常对照组比,沙格列汀干预组谷草转氨酶无显著变化(P>0.05)。(3)实验结束各组肝组织病理的情况与正常对照组比,模型对照组肝细胞内大量脂滴聚集,细胞呈弥漫小泡性脂肪空泡变性、重度水样变性,细胞核被挤压变形部分消失,肝索紊乱,肝窦狭窄或消失。与模型对照组比,沙格列汀干预组肝细胞内空泡脂滴减少、胞体无明显肿胀,肝细胞脂肪变性和水样变性程度明显减轻。结论：沙格列汀能有效降糖,并改善肝功能、改善肝组织脂肪变性。第二部分从氧化应激、细胞超微结构、凋亡蛋白方面讨论沙格列汀改善脂肪肝病情的可能作用机制目的：从氧化应激失衡、保护肝细胞等方面寻找沙格列汀改善脂肪肝病情的可能作用机制。方法：(1)检测10%肝组织匀浆中超氧化物激化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量制备10%肝组织匀浆,BCA法检测肝组织蛋白含量、水溶性四唑氮法(WST-1法)检测SOD、硫代巴比妥酸(TBA法)检测MDA含量。(2)透射电子显微镜观察各组肝细胞超微结构按照取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤完成。(3)免疫组化法、Western blot法检测肝脏组织Bcl-2、Bax蛋白的表达按照取石蜡片脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化氢酶活性、进行血清封闭、滴加一抗、二抗,DAB显色、复染的步骤完成免疫组化法定性检测肝脏Bcl-2/Bax的表达。按照抽提细胞膜蛋白与细胞浆蛋白、测定蛋白含量、SDS-聚苯稀酰胺凝胶电泳、蛋白膜转移、免疫杂交与显色检测蛋白的步骤完成Westernblot法检测。结果：(1)实验结束各组10%肝组织匀浆中SOD、MDA表达情况与正常组对照比,模型对照组抗氧化指标SOD下降,脂质过氧化指标MDA升高,差异显著(P<0.01)；与模型对照组比,沙格列汀干预组SOD升高(P<0.01),MDA降低(P<0.05),均差异显著。(2)实验结束各组肝脏组织细胞超微结构情况与正常对照组比,模型对照组细胞浆内见大量脂肪滴,粗面内质网水肿、离散,线粒体数目减少、结构肿胀紊乱。与模型对照组比,沙格列汀干预组细胞浆内脂肪滴减少,内质网围绕核膜排列整齐,线粒体密度增多,结构较清晰。(3)实验结束各组肝组织Bcl-2、Bax蛋白的表达情况免疫组化法、Westernblot检测结果一致,与正常对照组比,模型对照组Bax表达增多,Bcl-2表达减少；与模型对照组比,沙格列汀干预组Bax表达减少,Bcl-2表达增多。结论：沙格列汀可能通过调节氧化应激失衡,减少细胞超微结构的损伤,调节肝组织凋亡蛋白表达来保护肝细胞。