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[目的]探讨指数富集配体的系统进化(CELL-SELEX)技术筛选人膀胱癌EJ细胞的特异性核酸适配体的价值,检测核酸适配体与EJ细胞结合的亲和力和特异性,评价筛选得到的核酸适配体是否可作为一种分子探针用于诊断膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC).[方法]1.体外化学合成法建立单链DNA(ssDNA)文库,以EJ细胞作为阳性筛选细胞,人正常尿路上皮永生化细胞HCV29作为阴性筛选细胞。2.每一轮筛选得到的ssDNA进行PCR扩增,PCR产物长度用琼脂糖凝胶电泳检测,流式细胞术监测核酸适配体筛选进程。3.根据流式检测结果,对EJ细胞结合率最大的ssDNS文库进行PCR扩增,产物经DNA纯化试剂盒提纯、克隆和测序。根据测序结果,通过RNA结构软件对ssDNA进行二级结构的分析和预测。4.流式细胞术检测核酸适配体与EJ细胞结合的荧光强度,根据流式检测结果,计算出核酸适配体的解离常数(Kd),分析核酸适配体对靶细胞的亲和力。5.亲和力最高的核酸适配体用FITC荧光基团标记后,分别与EJ细胞、HCV29细胞、HepG2细胞以及293T细胞共孵育,通过流式细胞仪监测其与上述细胞的结合能力,分析核酸适配体与靶细胞结合的特异性。[结果]1.初始DNA文库由两端固定序列21nt,中间随机序列49nt,全长91nt的ssDNA构成,通过CELL-SELEX技术,经13轮的循环筛选,得到与EJ细胞特异结合的ssDNA,经琼脂糖凝胶电泳检测该DNA片段长度约为91bp。2.测序结果显示ssDNA包含3种不同的核酸序列,分别命名为L1、L2、L3。3种ssDNA的二级结构主要为茎环结构,符合核酸适配体的结构特性。3.3种核酸适配体分别与EJ细胞结合,核酸适配体Ll的Kd为35.2nM,低于核酸适配体L2、L3 (L2:Kd=82.7nM,L3:Kd=93.5nM)。核酸适配体L1与EJ细胞的亲和力高于核酸适配体L2、L3。流式细胞术检测结果显示核酸适配体L1能特异性结合EJ细胞,与Hcv29、293T、HepG2无明显结合。[结论]我们通过CELL-SELEX技术成功筛选到人膀胱癌EJ细胞的核酸适配体L1,其二级结构符合核酸适配体的结构特性。Ll能特异性结合EJ细胞,并具有高亲和力。