1研究背景及目的临床肿瘤患者常见血液高凝状态,其主要核心病理机制是“肿瘤-血小板”复合物所形成的瘤栓所引发。中医药理论中活血化瘀药常用于治疗肿瘤血瘀证患者,但是活血化瘀中药的抗癌应用机理尚不明确,对于肿瘤转移的促抑影响也一直存在着争议。本课题选取活血化瘀代表性中药鸡血藤,通过体内、外实验,以“肿瘤-血小板”相互作用以及肿瘤血液微环境作为切入点,以期阐释鸡血藤提取物（SEA）抗肿瘤转移的药效和药理学机制,拓展和明确鸡血藤抗癌机理的认知,并为其临床新药研发,特别是以肿瘤转移为靶点的药物研发提供全新的提示和有价值的证据支持。2研究内容和方法2.1鸡血藤乙酸乙酯提取物（SEA）体外抑制肿瘤细胞诱导的血小板激活的药效评价①将获取的鸡血藤乙酸乙酯提取物制备成SEA工作液（4mg/mL）,-20℃保存备用。②小鼠目内眦取血,获取富血小板血浆,制备洗涤血小板悬液。③检测SEA对血小板LDH释放以及对MC38肿瘤细胞的细胞毒性影响,以不影响细胞的生存为前提,确定体外SEA的作用浓度和时间（100 μg/mL,24h以内）。④采用小鼠MC38细胞建立体外诱导血小板聚集模型,模拟肿瘤细胞在血液里对血小板的活化、激活作用,确定模型中最佳的肿瘤细胞与血小板数目比例。⑤检测SEA对MC38细胞诱导血小板聚集的影响。⑥通过CFDA-SE标记血小板,利用激光共聚焦和流式细胞术定性、定量的检测SEA对“肿瘤-血小板”复合物形成的影响。2.2“肿瘤-血小板”互作下,SEA对肿瘤细胞EMT及干性的影响2.2.1 SEA对“肿瘤-血小板”互作下肿瘤细胞EMT进程的影响在体外明确SEA阻断肿瘤细胞对血小板活化的基础上,将肿瘤细胞与血小板体外共培养20 h,建立“肿瘤-血小板”共培养模型。①观察、检测共培养体系中模型组及SEA给药组里MC38细胞的形态学变化（长宽比统计）。②比浊法检测SEA对共培养体系下MC38细胞诱导血小板聚集的能力。③～④在共培养体系下,qPCR、WB实验分别检测SEA对MC38细胞EMT调控转录分子Snail-1、Vimentin、Cdh-1、Slug 和 Twist-1 的表达影响、对 EMT 相关蛋白分子 E-cadherin、Vimentin的表达影响。⑤通过划痕修复实验检测SEA对MC38细胞运动能力的影响。⑥通过明胶酶谱实验检测SEA对MMP-9活性的影响。⑦通过Tanswell实验检测SEA对MC38细胞侵袭能力的影响。2.2.2“肿瘤-血小板”互作下,SEA对MC38细胞干性的影响在确定SEA能够有效逆转“肿瘤-血小板”互作模型下MC38细胞EMT转变的基础上,在互作模型下进一步分别检测:①SEA对MC38细胞干性转录分子Sox2、Oct4、Nanog和Bmi1的表达影响（qPCR实验）。②～③SEA对MC38细胞干性标志物CD44、CD133、（WB实验、FACS实验）和c-Myc的蛋白表达影响（WB实验）。④通过克隆增殖实验检测SEA对MC38细胞克隆形成能力的影响。⑤通过软琼脂集落形成实验检测SEA对MC38细胞非锚定集落形成能力的影响。⑥通过肿瘤细胞成球实验检测SEA对MC38细胞自我更新能力的影响,对其干性功能进行综合评价。2.2.3“肿瘤-血小板”互作模型对SEA药效发挥的影响在共培养模型下,明确了 SEA具有逆转MC38细胞EMT转变及降低干性的药效以后,为了进一步确定SEA的药效发挥否是基于“肿瘤-血小板”互作模型下实现的,我们将血小板去除,分别检测:①SEA对MC38细胞干性转录分子Sox2、Oct4、Nanog和Bmi1的表达影响（qPCR实验）。②SEA对MC38细胞干性标志物CD44、CD133、c-Myc和Oct-4的蛋白表达影响（WB实验）。③SEA对MC38细胞干性标志物CD44、CD133表达的影响（FACS实验）。2.3 SEA对荷瘤小鼠血行转移的影响及分子机制研究2.3.1 SEA对荷瘤小鼠血行转移的影响为了检测SEA在体内是否具有抑制MC38细胞转移的药效以及作用机制为何,分别进行了如下实验:①首先使用MC38-Luc细胞,于尾静脉注射进C57BL/6J小鼠体内（1×105/只）,构建血行转移模型,SEA体内给药组每日灌胃给药SEA（4mg/kg）,1次/d;在此基础上,对肿瘤细胞处理方式和给药方案进行专门设计（设置体外血小板预处理肿瘤细胞组及体外SEA（100 μg/mL）给药组）,以确证SEA阻断T-P互作进而抑制结肠癌转移作用的特异性。接种后第14天进行小动物成像。②检测SEA对正常小鼠和荷瘤小鼠的凝血功能影响（复钙实验）。③小动物活体成像法检测SEA对小鼠转移灶分布及数量的影响。③检测SEA对荷瘤小鼠外周血血小板数目的影响（生化检测）。④HE染色法检测SEA对荷瘤小鼠肺组织结构状况的影响。⑤免疫组化法检测SEA对荷瘤小鼠肺转移灶组织CD44、N-cadherin、MMP-9 的表达影响。2.3.2 SEA对“肿瘤-血小板”相互作用方式的影响机制上,利用凝血酶（0.5 U/mL）体外诱导血小板激活,将激活血小板碎片与血小板释放物分离,并将血小板（Platelets）、血小板碎片（pellet）、血小板释放物（releasate）分别与MC38细胞相互作用20h,空白组用1640培养基进行对照（buffer）,分别检测:①MC38细胞EMT样形态学改变。②～③MC38细胞干性分子CD44、CD133的蛋白表达变化（WB实验、FACS实验）。④进一步,利用Transwell小室,将肿瘤细胞与血小板相互隔离后进行共培养20h,检测模型组和SEA组在此条件下对MC38细胞的EMT分子E-cadherin、Vimentin表达和⑤对MC38细胞运动能力的影响（划痕修复实验、Transwell迁移实验）。2.3.3 SEA对“肿瘤-血小板”互作相关信号通路的影响最后,通过TGF-β、NF-κB和β-catenin阻断剂进行干预,检测EMT关键蛋白分子E-cadherin的表达变化,从而对SEA药物阻断“肿瘤-血小板”互作的信号通路进行了初步的研究。3研究结果3.1 SEA体外抑制肿瘤细胞诱导的血小板激活的药效评价①LDH、CCK-8结果显示,100 μg/mL以下的SEA对血小板LDH释放无增强作用,对MC38细胞无细胞毒性作用。综合考虑了剂量和时间因素,最终选择25、50、100 μg/mL的SEA处理20 h作为后续实验的处理条件。②血小板聚集率实验结果显示,当肿瘤细胞与血小板数目比为1:100时,MC38能够诱导血小板出现最大聚集率。在此条件下,SEA相比其他活血化瘀药单体（丹参酮ⅡA、丹酚酸A、川芎嗪和β-榄香烯）以及对照药阿司匹林,具有显著抑制MC38细胞诱导的血小板聚集药效（P＜0.01）。③共聚焦显微镜和流式细胞检测结果显示,SEA显著降低了 MC38细胞对血小板的活化、粘附作用,阻断“肿瘤-血小板”复合物的形成（P＜0.01）。3.2“肿瘤-血小板”互作下,SEA对肿瘤细胞EMT及干性的影响3.2.1“肿瘤-血小板”互作下,SEA对肿瘤细胞EMT进程的影响在“肿瘤-血小板”共培养20 h模型下,对EMT相关的检测结果分别是:①形态学观察结果显示,模型组中血小板诱导了 MC38细胞出现了显著的EMT样改变（P＜0.01）,SEA的干预可以明显逆转MC38细胞EMT样转变（P＜0.01）。②血小板聚集率实验结果显示,与血小板处理20 h后的MC38细胞相比未处理的MC38细胞,诱导血小板聚集的能力显著增强（P＜0.01）,在此条件下,SEA相比各单体化合物依旧具有显著抑制MC38细胞诱导血小板聚集的能力（P＜0.01）。③qPCR结果显示,SEA明显逆转了模型组中EMT相关转录分子Snail-1、Vimentin、Cdh-1、Slug的表达（P＜0.01）。④WB结果显示,SEA明显逆转了模型组中E-cadherin和Vimentin的蛋白表达（P＜0.01）;⑤划痕修复实验结果显示,在初始划痕宽度一致的前提下,SEA处理组的MC38细胞在20 h之后,划痕宽度明显大于模型组（P＜0.01）;⑥侵袭实验结果显示,与模型组相比,SEA处理组的MMP-9活性和穿膜细胞数明显减少（P＜0.01）。3.2.2“肿瘤-血小板”互作下,SEA对MC38细胞干性的影响在“肿瘤-血小板”共培养20 h模型下,对MC38细胞干性相关的检测结果分别是:①qPCR=结果显示,SEA明显降低了 Sox2、Oct4和Nanog的转录水平表达（P＜0.01）。②WB和FACS结果共同显示,结肠癌干性标志物CD44、CD133和c-Myc的蛋白表达,在SEA干预下显著降低（P＜0.01）。在干性功能实验中,结果显示:③与模型组相比,SEA处理组中,MC38细胞克隆数明显降低（P＜0.01）;④与模型组相比,SEA处理组中,MC38细胞非锚定集落形成能力显著降低（P＜0.01）;⑤与模型组相比,SEA处理组中,MC38细胞成球能力显著降低（P＜0.01）。3.2.3“肿瘤-血小板”互作模型对SEA药效发挥的影响在去除了血小板的条件下,验证SEA药效是否具有药效,结果分别是:①qPCR结果显示,SEA单独对MC38细胞干性转录分子Sox2、Oct4、Nanog和Bmi1的表达无显著性影响（P＞0.05）。②WB和FACS结果共同显示,SEA单独对MC38细胞干性标志物CD44、CD133、c-Myc和Oct-4均无显著性影响（P＞0.05）。3.3 SEA对荷瘤小鼠血行转移的影响及分子机制研究3.3.1 SEA对荷瘤小鼠血行转移的影响通过尾静脉注射MC38-Luc细胞建立小鼠结肠癌血行转移模型,并通过体外对MC38细胞特殊处理及给药,验证SEA在体内阻断MC38细胞转移的特异性药效,实验结果分别是:①复钙实验显示,与正常小鼠相比,未荷瘤小鼠在给予SEA药物后,复钙时间未发生显著性改变（P＞0.05）,但荷瘤小鼠复钙时间显著低于未荷瘤正常小鼠（P＜0.01）;与荷瘤小鼠相比,小鼠每日给予SEA药物后,血浆再钙化时间显著增加（P＜0.01）,并恢复至正常水平。②小动物活体成像结果显示,阴性对照组中肺部荧光信号明显,转移灶集中于肺部。在小鼠每日给予SEA药物后,肺部转移灶信号显著减少（P＜0.01）;另外,与阴性对照组相比,当MC38细胞体外与血小板预处理后,体内肺转移灶荧光信号显著增强（P＜0.01）,说明血小板增强了 MC38细胞的转移能力,而在此基础上,体外SEA给药组与之相比,肺部转移灶数目显著降低（P＜0.01）。结果说明SEA通过阻断“肿瘤-血小板”互作进而抑制了 MC38细胞在体内的转移。③血小板数目检测结果显示,荷瘤小鼠体内外周血血小板数目相比于正常小鼠明显下降（P＜0.01）,而体内给予SEA药物或者体外加入SEA干预后,均能显著改善相对应模型组中血小板数目的减少（P＜0.01）。实验结果说明,SEA调控“肿瘤-血小板”互作并不依赖于对血小板数目的改变。④HE染色结果显示,NC组小鼠肺组织中有部分肿瘤细胞浸润,肺泡结构受到破坏;在platelets组中,肿瘤细胞浸润程度更加严重,肺组织结构被严重破坏,实变程度更加明显。SEA体内、外给药组中,肺组织形态明显改善,肺部结构基本正常,肺组织实变程度明显减少,基本无肿瘤细胞浸润情况。本实验结果说明,SEA抑制结肠癌肺转移的药效活性是通过阻断“肿瘤-血小板”互作发挥作用。⑤免疫组化结果显示,CD44、N-cadherin、MMP-9在NC组中表达明显,在Platelets组中表达量进一步增高,且有大量转移灶;在SEA体内、外处理组中,阳性信号明显降低,且未见肿瘤转移灶。3.3.2 SEA对“肿瘤-血小板”相互作用方式的影响在确证了 SEA通过阻断“肿瘤-血小板”互作进而在体内抑制MC38细胞血行转移的药效基础上,对“肿瘤-血小板”相互作用方式及SEA的干预进行深入的研究,结果发现:①形态学观察显示,完整血小板与血小板碎片均能诱导MC38细胞EMT样变化,而血小板释放物无法诱导EMT样转变,SEA可以阻断血小板及血小板碎片所诱导的EMT转变。②在上述形态学观察的基础上,通过WB和FACS检测各组CD44、CD133干性标志物的表达,结果显示,MC38细胞与完整血小板或者血小板碎片共同孵育20h后,CD44、CD133表达显著增加（P＜0.01）,SEA给药组能够明显抑制模型组中的表达（P＜0.01）;而血小板释放物组对CD44、CD133的表达无显著性影响（P＞0.05）。进一步,我们利用Transwell小室将“肿瘤-血小板”互作模型中MC38细胞与血小板相互隔离,并给予SEA处理,同时在模型组基础上加入凝血酶诱导血小板激活。结果分别显示:③WB结果显示,模型组、SEA组以及凝血酶处理组中,MC38细胞EMT相关分子E-cadherin和Vimentin的表达均无改变（P＞0.05）。④～⑤划痕实验与迁移实验结果共同显示,模型组、SEA组以及凝血酶处理组中,MC38细胞的运动、迁移能力无显著性变化（P＞0.05）。实验结果说明,SEA的药效机制是阻断肿瘤细胞与血小板的直接相互接触。3.3.3 SEA对“肿瘤-血小板”互作相关信号通路的影响通过TGF-β、NF-κB和β-catenin阻断剂进行干预实验,结果显示:①TGF-β阻断剂降低了 SEA组中E-cadherin的蛋白表达（P＜0.01）。实验结果说明,SEA并非通过阻断TGF-β发挥药效。②β-catenin阻断剂的加入,不会改变SEA组中E-cadherin的蛋白表达水平（P＞0.05）。实验结果说明SEA药效与β-catenin阻断EMT的效果相同。③NF-κB阻断剂的加入会在SEA的基础上进一步恢复E-cadherin的表达（P＜0.01）,说明阻断NF-κB能够额外协同SEA药效的发挥,即说明NF-κB信号通路并非是SEA发挥药效的机制。以上实验初步说明,SEA阻断“肿瘤-血小板”互作的机制,依赖于阻断β-catenin信号通路。4结论SEA能够特异性抑制MC38肿瘤细胞诱导的血小板聚集,阻断肿瘤细胞与血小板的直接相互接触,并通过抑制β-catenin信号通路降低肿瘤细胞恶性程度,发挥阻碍结肠癌转移的药效,抑制转移灶的产生。