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体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术在科研、动物育种、转基因动物生产、医疗等领域具有巨大的作用,但其极低的效率严重限制了这一技术的应用。体细胞继代克隆(Serial SCNT,SSCNT)技术可以通过重复利用受体胞质对供体细胞进行重编程,理论上将有望提高体细胞的重编程效率和克隆胚胎的发育率。因此,本研究对水牛SSCNT及其分子机制进行了初步的研究,具体结果如下:1.探讨了水牛SSCNT胚胎的体外发育情况及其表观遗传修饰状态。使用普通水牛耳部成纤维细胞BFF,由该BFF细胞系制备的转催乳素PRL的转基因细胞BFF-PRL以及使用BFF-PRL作为供体细胞进行核移植获得的克隆水牛耳部成纤维细胞(编号为8811)进行体细胞核移植,发现使用8811细胞作为供体所得的继代克隆胚胎(SSCNT胚胎)囊胚发育率显著高于BFF和BFF-PRL组,且SSCNT囊胚中5mC和组蛋白H3K9me3的水平出现显著下调(P<0.05)。另外,SSCNT囊胚中Dnmtl,HDAC1,HDA4C2的表达水平出现了显著的下调,多能基因Oct4,Sox2和Nanog的表达水平出现了显著的上升(P<0.05)。结果表明,由于DNA甲基化和组蛋白甲基化水平的下降,水牛SSCNT胚胎的发育潜能要高于普通的SCNT胚胎。2.通过比较BFF,BFF-PRL和8811三株供体细胞的生长特性和表观遗传修饰状态,对水牛SSCNT的分子机制进行了初步的探讨。结果发现:三株细胞在形态和生长能力方面无显著差异;而且三株细胞在5mC、组蛋白H3K18乙酰化、H3K9me2/me3表达、印记基因H19和IGF2启动子区的甲基化水平及表达水平上,均无显著差异(P>0.05)。该结果表明,供体细胞表观遗传修饰的起始状态,不是导致牛SSCNT胚胎的发育效率提升的主要原因,推测SSCNT胚胎发育效率的提升与供体细胞和卵胞质充分接触有关。3.探讨了卵胞质提取物处理供体细胞对水牛SCNT效果的影响。分别使用水牛GV期/MII期卵胞质提取物孵育BFF,结果发现GV期卵胞质孵育能显著降低BFF中5mC和H3K9me3的水平(P<0.05;);且后续SCNT胚胎的囊胚率和囊胚细胞数显著提高(P<0.05),同时SCNT囊胚中5mC和组蛋白H3K9me3的表达水平显著降低(P<0.05);此外,SCNT囊胚中Oct4,Sox2和Nanog的表达水平经GV期卵胞质孵育供体后均出现了显著的提升(P<0.05)。该结果表明卵胞质充分孵育供体细胞,能够影响供体细胞的表观遗传修饰状态,提高后续克隆胚胎的发育效率,故推测是卵母细胞胞质中的某些母源因子在这一过程中发挥了关键的作用。4.作为一种关键的母源因子,KDMLA在调控组蛋白甲基化的过程中发挥了关键的作用。故对水牛GV期和MII期卵母细胞中KDM1A的表达模式进行了分析,发现KDM1A在GV期和MII期卵母细胞中均呈现为高表达状态,且GV期的表达水平要高于MII期(<0.05)。随后克隆获得了KDMLA基因编码区片段,并对其进行了生物信息学分析,最后还构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,并对载体的表达效率进行了验证,确定其能够提高BFF中KDM1A的表达水平。5.通过过表达水牛SCNT胚胎中KDMLA的表达水平,探讨了母源因子KDM1A对水牛SCNT胚胎发育的影响。胚胎显微注射结果显示,显微注射KDM1A mRNA能够显著提高各阶段SCNT胚胎中KDM1A的表达水平(P<0.05);过表达KDM1A,SCNT的8细胞率,桑椹胚率和囊胚率均显著提高(P<0.05);另外,过表达KDM1A还显著降低了SCNT胚胎中H3K9me3的水平(P<0.05),提高了 8细胞期SCNT胚胎中合子基因激活相关基因eIF-3a,TRC,SUPT4H1,SNAI1和ZSCAN5B,以及组蛋白甲基化酶相关基因KDM4B,KDM4D的表达水平(P<0.05)。该结果表明,过表达克隆胚胎中的母源因子KDM1A,能够降低组蛋白H3K9me3水平,激活合子基因,从而提高克隆胚胎的发育效率。上述研究结果表明:(1)水牛SSCNT胚胎的发育潜能要高于普通的SCNT胚胎,其原因可能是由于继代克隆供体细胞更易于被受体胞质重编程,而不是供体细胞表观遗传修饰的起始状态;(2)卵胞质孵育使供体细胞得以与卵母细胞胞质充分接触,能促进供体细胞的重编程,进而提高其随后SCNT胚胎的发育率;(3)卵胞质中的母源因子KDMLA在卵胞质中高表达,KDMLA通过发挥其去甲基化和激活合子基因的作用,使组蛋白H3K9me3的水平显著降低,合子基因激活相关基因的表达水平显著提升,进而提高了继代克隆胚胎的发育率。