猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是引起猪肠道疾病的α冠状病毒之一,可导致大量初生仔猪腹泻、脱水甚至死亡,严重危害养猪业发展。PEDV的致病机理主要是肠道上皮细胞被破坏导致其腹泻,而PEDV破坏肠道上皮细胞的机制可能包括:细胞凋亡、坏死和炎症反应。p53具有调节细胞凋亡生物学功能,同时也参与对病毒复制的影响。NF-κB信号通路与细胞凋亡也密切相关。因此本研究通过探析PEDV侵染宿主细胞后引起p53蛋白及NF-κB信号通路相关蛋白的表达或修饰变化,以求解析PEDV的致病分子机制。本研究针对PEDV对p53信号分子的影响,借助免疫印迹、间接免疫荧光、Co-IP等技术,获得如下研究结果:PEDV感染宿主细胞后期(24、48h)会引起p53蛋白的下调,且PEDV引起的p53蛋白表达量下调是由泛素化所致;为了解析参与p53的降解和泛素化的PEDV病毒蛋白,构建了PEDV-NSP7、PEDV-S2、PEDV-M、PEDV-N真核表达质粒,真核表达筛选出PEDV-N参与调控p53蛋白总蛋白的减少,促进p53修饰蛋白增加,该修饰同样为泛素化修饰;为了进一步解析PEDV-N是否直接参与调控p53蛋白的修饰,Co-IP进一步证实PEDV-N能和p53相互作用,且p53被PEDV-N阻挡在细胞核膜外围,阻止部分p53入核,进而可能影响其功能发挥。本研究进一步探析PEDV感染宿主细胞后对NF-κB信号通路相关分子表达,利用免疫印迹、间接免疫荧光、激光共聚焦显微镜成像等技术,获得如下结果:PEDV感染细胞24小时后,NF-κB家族蛋白p105/p50和p65蛋白的表达明显下调;PEDV-N蛋白的真核表达也能促进NF-κB家族蛋白表现出和PEDV病毒感染细胞相同规律,且随着PEDV-N表达量增加,p105/p50和p65蛋白的表达下调更加明显;IFA和激光共聚焦显微镜成像表明,PEDV-N与NF-κB家族蛋白中的p105/p50和p65蛋白均表达于细胞质中,存在一定的共定位现象。综上所述,PEDV侵染宿主细胞后可引起对p53蛋白的表达量下调是由于p53的泛素化增加所致,且PEDV-N通过与p53共定位和相互作用参与了该过程,同时PEDV感染也会下调NF-κB相关蛋白的表达,PEDV-N也参与其中。因此本研究初步解析PEDV侵染宿主细胞影响p53及NF-κB信号通路的机制,为详细揭示PEDV的致病分子机理奠定了一定基础。