竹子是世界重要的森林资源之一,随着全球环境的变化和森林资源的锐减,竹子作为一种生长迅速、再生性强的非木质植物资源,在缓解木材供需矛盾方面发挥着重要作用,其开发利用受到了国际社会的高度关注。竹子纤维素含量直接影响到其应用价值,而纤维素合成酶是纤维素生物合成的关键酶和特征酶,纤维素合成酶基因的转录与表达水平直接影响到纤维素的含量和品质,从而影响到竹子的经济价值。本论文以中国重要经济竹种毛竹(Phyllostachys edulis)为材料,利用RT-PCR和RACE方法克隆到5个维素合成酶基因PeCesA1(登录号FJ495287)、PeCesA2(登录号FJ475350)、PeCesA4(登录号FJ475351)、PeCesA6及PeCesA7。运用分子生物信息学方法对核苷酸序列及其编码的氨基酸序列了进行分析。将PeCesA1和PeCesA4构建到原核及毕赤酵母表达载体上,进行了异源表达研究。利用GatewayTM克隆技术构建了PeCesA1的植物表达载体,通过转化烟草叶片,获得了转基因抗性芽。建立了麻竹愈伤再生体系,并对毛竹种胚愈伤再生体系进行了探讨。主要结果如下:1.毛竹纤维素合成酶基因克隆与分析(1) PeCesA1基因cDNA长3 244 bp,开放阅读框为3 237 bp,编码1 078个氨基酸,理论分子量为121 586.02 Da,等电点7.12。聚类分析表明,PeCesA1蛋白序列与绿竹、水稻、玉米、大麦、杨树等的一致性在80%以上,其中与绿竹BoCesA1的一致性最高,达98%;其次是水稻,为97.5%;二级结构富含а-螺旋,β-折叠及L-环状区域,具有8个跨膜区及锌指结构域;球状结构预测显示PeCesA1属于结构致密的球状蛋白。(2)PeCesA2基因cDNA长3 215 bp,开放阅读框为3 213 bp,编码1 070个氨基酸,理论分子量为120 604.86 kDa,等电点6.55;蛋白结构预测表明,PeCesA2包含一个纤维素合成酶保守域的同时,还包含2个氨基化位点、3个N-糖基化位点、9个酪蛋白激酶II磷酸化位点、12个N-肉豆蔻酰化位点、14个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点;1个赖氨酸富集区、2个双向定位信号和2个锌指结构域。(3)PeCesA4基因cDNA长3 257 bp,开放阅读框为3 246 bp,编码1081个氨基酸,理论分子量为120 928.68 kDa,等电点7.57;蛋白结构预测表明,PeCesA4包含一个纤维素合成酶保守域的同时,还包含2个氨基化位点、7个N-糖基化位点、2依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、10个酪蛋白激酶II磷酸化位点、16个N-肉豆蔻酰化位点、14个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点;1个赖氨酸富集区、2个双向和定位信号、2个锌指结构域。(4)PeCesA6基因片段长1 462 bp,包括3’端621 bp非编码区。PeCesA7含有990bp的保守区。(5)通过构建系统进化树分析比较,推测PeCesA1、PeCesA2、PeCesA4可能与毛竹细胞初生壁纤维素合成有关,PeCesA6、PeCesA7可能与毛竹细胞次生壁纤维素合成有关。(6)基因表达分析表明,PeCesA1、PeCesA6、PeCesA7的表达谱存在着差异。PeCesA1茎部表达量最高,芽、根、叶次之,在箨片中未检测到;PeCesA6在根、茎、叶及箨片中均有表达,以根和箨片中表达量最高,其次是茎、芽,在叶中表达量最低;PeCesA7芽、根、茎、叶及箨片中均有表达,其中以叶片中表达量最低,其余器官无明显差异。2.PeCesA1和PeCesA4基因在大肠杆菌中的表达采用TA克隆的方法直接将PeCesA1基因的PCR产物链接到pEASY-E1表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经1 mmolL-1M IPTG诱导在120 KD处有一特征带,实现了其在大肠杆菌中表达。通过比较重组蛋白His-PeCesA1在BL(DE3)、BL(DE3)plysS及Rossata(DE3)菌株中表达情况发现,在BL(DE3)plysS菌株中表达量最高,其中30℃表达量明显高于37℃。同时又以pGEX-4T-1为载体,将PeCesA4基因序列构建到高pGEX-4T-1表达载体上。SDS-PAGE电泳结果发现,融合蛋白GST-PeCesA4的表达量明显高于His-PeCesA1,在25℃~43℃温度范围内,重组蛋白的表达量随着温度增高而提高,40℃表达量达到最高峰,43℃重组蛋白不表达。3. PeCesA1在毕赤酵母中的表达利用亚克隆技术将毛竹PeCesA1构建到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,成功地构建了PeCesA1基因的真核表达载体pPIC9K- PeCesA1;重组载体经PmeI线性化后电转化毕赤酵母KM71,PCR检测获得了7个转化子,诱导表达后SDS-PAGE结果未发现特征带。4.PeCesA1基因植物表达载体构建及烟草叶片、悬浮细胞BY-2的转化应用GatewayTM技术将PeCesA1通过BP反应克隆到pDONR207中,构建了入门载体pDONR207- PeCesA1,然后通过LR反应将入门克隆上的目的基因平行构建以绿色荧光蛋白(GFP)为选择标记的pH7WG2D或pH7WGF2植物表达载体上,构建了35 S启动子调控的组成性二元植物表达载体pH7WGF2-PeCesA1及pH7WG2D-PeCesA1。通过叶盘法转化烟草叶片,获得了转PeCesA1基因抗性芽。利用农杆菌侵染烟草悬浮细胞BY-2,获得抗性细胞团。通过荧光共聚焦显微镜观察,GFP-PeCesA1在抗性芽及悬浮细胞中都得到表达。5.愈伤受体转化系统的建立与探讨以麻竹试管苗茎段及茎尖为外植体,对影响麻竹愈伤再生体系的因子进行了研究。筛选出最适愈伤诱导培养基为:MS+3 mg·L-1 2,4-D+0.02 mg·L-1KT;最适不定芽分化培养基为:MS+3 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IBA;不定根诱导培养基为:1/3MS+3 mg·L-1 IBA,不定根生长培养基为1/3MS+1 mg·L-1 IBA+0.05 mg·L-1 6-BA。通过脱分化所建立的麻竹胚体细胞系的再生特性已保持了一年以上。以毛竹成熟种子为外植体进行了愈伤诱导,结果发现:2,4-D浓度在4～8 mg·L-1之间均能诱导愈伤组织发生,以5 mg·L-1 2,4-D效果最好;在所使用的四种基本培养基中,M4(HB大量+ 1/2MS微量+ 1/2MS钙盐+1/2 MS铁盐+ 8 mg·L-1VB1+ 200 mg·L-1肌醇)愈伤诱导率最高,配合使用低浓度的0.02 mg·L-1KT提高2,4-D的诱导效果。