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人肿瘤坏死因子是迄今为止人们发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。但是目前天然TNF仅限于局部使用治疗肢体软组织肉瘤，在TM／ILP和TNFerade的治疗方案中，TNF的作用主要是破坏肿瘤血管内皮细胞，改变内皮细胞的屏障功能。AngeloCorti等人构建了NGR-TNF融合蛋白，利用NGR肽与新生血管内皮细胞表面CD13分子的高亲和力结合，将TNF在肿瘤组织中富集，当联合化疗药物或放射线治疗时，TNF作用于内皮细胞，化疗药物或放射线作用与肿瘤细胞，从而大大降低的TNF的用量(ng水平)，同时降低毒副作用。 RGD4C肽是利用噬菌体表面呈现技术筛选得到的能够与新生血管内皮细胞表面αvβ3整合素结合的肽。利用RGD肽与αvβ3整合素的高亲和力结合特性，人们已经成功的将病毒载体、放射性示踪剂等靶向性运输到肿瘤组织的新生血管处。利用靶向性多肽作为导向分子构建融合蛋白，具有易于制备、免疫原性低的优点。 由本科室构建的重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)具有高效低毒的优点，已经SFDA批准联合化疗药物用于晚期肺癌的治疗，但是仍需要较大的剂量。为了进一步提高rmhTNF的疗效，降低毒副作用，同时降低用量，我们将RGD肽融合在rmhTNF的N末端，构建了RGD4C-rmhTNF，希望该融合蛋白能够特异性的作用于肿瘤新生血管的内皮细胞，改变内皮细胞的屏障功常四门阵医大学傅士学七立勺仑文能，与化疗药物协同作用，以更好的杀死肿瘤细胞。国内外至今未见RGD肤与:mhTNF融合蛋白的相关报道。L RGD4C一rmhTNF重组蛋白的实验室研究 本研究首先采用DNA重组技术正确构建了含RGD4C一rmhTNF的融合基因的原核表达载体pBV一RGD4C一rmhTNF，含该表达载体的E.eoli nH5a经温度诱导后可以以可溶性形式表达重组蛋白RGD4C一rmhTNF，表达量占菌体可染蛋白的7%左右，与抗TNF单抗可以特异性结合。用SL自动控制发酵罐对重组工程菌进行了发酵培养，菌体裂解上清对L929细胞的杀伤活性为5 x10”IulL。经过硫酸钱分段盐析、阴阳离子交换层析分离纯化，得到了纯度>95%的重组蛋白，比活性达到2 xlo8luzmg。并证实纯化的ReD4e一rmhTNF在溶液中以单体、二聚体、三聚体的混合形式存在。2.RGD4C一rmhTNF的中试工艺及质量标准研究 在证实重组蛋白RGD4C一rmhTNF具有生物学活性后，为了获得足够的样品进一步研究其在体内外的抑瘤活性，我们对发酵和纯化工艺进行了放大，纯化了两批RGD4C一rmhTNF，得到高度纯化的RGD4C一rmhTNF 93.92mg和115.7mg，活性回收率分别为91.43%和95.59%，目的蛋白纯化倍数分别为26.巧倍和22.64倍。通过对重组蛋白结构、纯度、生物学活性和残留杂质等几个方面的控制，确认所得到的重组蛋白符合质量标准要求，并建立了重组蛋白制造与检定规程和质量标准。3、RGD4C一rmhTNF体内外抑瘤活性及其作用机理研究 用小鼠皮下移植瘤模型，观察了低剂量RGD4C一rmhTNF单用对肿瘤生长的影响及与阿霉素的协同作用，同时和rmhTNF进行了比较。研究结果表明，10000一25000ou/kg rmhTNF和RGD4C一rmhTNF隔日l次肌肉内注射，共6次，对5 1 80小鼠皮下移植瘤生长无明显影响。5000一500000U/kgrmhTNF和阿霉素联合应用，对阿霉素抗5180和H22鼠皮下移植瘤作用无明显影响。RGD4C一rmhTNF和阿霉素合用，不同程度的增强阿霉素抗节四闰民医，悦学俘d匕学亡主今仑j忆5150(10000一250000 uzkg)和H22(50000一500000 Ulkg)小鼠皮下移植瘤生长的作用，但量效关系不明显。RGD4C一rmhTNFim或iP对阿霉素抗5180小鼠皮下移植瘤的协同作用强度无显著性差别。 按性物技术药品临床前药动学研究指导原则》的要求，用有效协同阿霉素抗肿瘤的RGD4C一rmhTNF 50000U/kg(263ng/kg)对荷瘤小鼠im，用高灵敏度ELIsA试剂盒测定血清与肿瘤组织中的药物浓度，进行组织分布试验。结果，ELISA法测定Roo4e一rmhTNF时线性关系良好，可检出范围为0.5一32 pg/ml，灵敏度与同位素示踪法类似。血清中可检出微量RGD4C一rmhTNF，但肿瘤组织中RGD4C一rmhTNF浓度在检测限以下。等摩尔剂量的:mhTNF小鼠im后各时点在血清和组织中均未检出。 在体外研究了重组蛋白RGD4C一rmhTNF及两种化疗药物ADM和CBP单独使用时对人肺癌细胞SPC一A一1和小鼠腹水瘤细胞s一180的杀伤作用，发现:在不添加蛋白合成抑制剂Aetinomyeinn时，Roo4C一rmhTNF对上述两种细胞在培养24hr，48hrs，72hrs时，均没有杀伤作用。而ADM和CBP对上述两种细胞呈现明显的剂量依赖和时间依赖的细胞毒作用。 不同剂量RGD4C一rmhTNF(1 000IU/ml一62.5IU/ml)与ADM联合应用时，可显著降低阿霉素的IC30值。而RGD4C一rmhTNF一oooluzml与CBP联合应用时，可使CBP的IC30降低2.060倍;当RGD4C一rmhTNF的用量为250IU/ml和62.5IU/ml时，与CBP没有协同作用。 在体外初步研究了RGD4C一rmhTNF与ADM协同作用的机理。(l)不同剂量的RoD4e一rmhTNF(1 onglml一o.inglml)可以直接促进ADM进入人肺癌细胞SPC一A一1，但是量效关系不明显，以Ing/ml作用最强。(2达DM作用于人肺癌细胞SPC一A一16hrs后，可使Gl期细胞轻微降?