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本文以牛蛙Rana(Lithobates)catesbeiana为试验动物,研究饲料中添加两种蛙源产植酸酶菌(阴沟肠杆菌E.cloacae和枯草芽孢杆菌B.subtilis)对其生长、营养吸收及肠道健康的影响。主要研究内容如下:1.产植酸酶E.cloacae和B.subtilis的耐热性及产酶能力的研究从牛蛙肠道中筛选出两株产植酸酶细菌(E.cloacae和B.subtilis)。试验一,研究不同温度(25℃,28℃,31℃,34℃,37℃),不同培养周期(24 h,48 h,72 h,96 h)对B.subtilis产芽孢能力的影响,研究其最适产孢条件。试验二,通过设置5种不同温度(65℃、75℃、85℃、95℃、10~5℃),研究两株菌的耐热性。试验三,以WBE为植酸酶液体发酵培养基,30℃下摇瓶培养72 h,测定E.cloacae和B.subtilis的产酶能力。结果:试验一,B.subtilis最适产芽孢条件为(31℃,96 h),芽孢率>95%。试验二,B.subtilis具有较高的耐热性,10~5℃下存活率高达93.56%,而E.cloacae并不耐热。试验三,E.cloacae产酶能力为33.72 U/mL,B.subtilis产酶能力为26.31 U/mL。2.饲料中添加不同水平产植酸酶E.cloacae和B.subtilis对牛蛙生长性能、体成分和血清抗氧化能力的影响选取252只平均体重为(42.5±0.2)g的幼蛙,随机分为7个处理组,每个处理组3个重复,每个重复12只。试验选用两种产植酸酶细菌(E.cloacae和B.subtilis),每种细菌设3个添加梯度(10~5、10~7和10~9 cfu/g)以及对照组(无菌),共制作7种饲料,进行为期56d的摄食生长实验。结果:B.subtilis 10~9 cfu/g剂量组(KG)的饲料效率(FE)最高(1.21),除B.subtilis 10~7 cfu/g剂量组(KZ)外,显著高于其余各组(P<0.05)。E.cloacae添加组中,饲料效率(FE)和蛋白质效率(PER)都随E.cloacae添加量的升高呈上升趋势,在E.cloacae10~9 cfu/g剂量组(YG)时达到最大,显著高于对照组(P<0.05)。血清中总抗氧化力(TAOC)随着B.subtilis添加量的增加,T-AOC有先升高后降的趋势,在KZ达到最高水平且显著高于对照组(C)(P<0.05)。随饲料中两种产植酸酶菌添加量增加,血清CAT水平皆有先升高后降低趋势,分别在YZ和KZ组达到最高,但与对照组无显著差异(P>0.05);SOD水平皆有先升高后降低趋势,分别在YZ和KZ组达到最高。以上结果表明:饲料中添加E.cloacae(1×10~9)和B.subtilis(1×10~7和1×10~9)不影响牛蛙生长性能,但能够提高牛蛙FE和PER,提高血清抗氧化能力。3.产植酸酶E.cloacae和B.subtilis对牛蛙钙、磷沉积以及营养物质表观消化率的影响8周养殖试验结束后,对采样后剩余的牛蛙收集粪便并进行饲料营养物质表观消化率的测定试验。结果:随着两种菌添加量的增加,牛蛙全体钙、磷水平皆有上升趋势,在YG和KZ达到最大值,且显著高于对照组(P<0.05)。血清磷水平随B.subtilis添加的增加显著升高(P<0.05),KG达最大值,且显著高于对照组(P<0.05)。碱性磷酸酶(AKP)随两种产植酸酶菌添加量增加,皆有降低趋势。由表观消化率结果可知,随两种产植酸酶菌添加量增加,干物质的表观消化率分别在YG和KZ达最大值且显著高于对照组(P<0.05)。随B.subtilis添加量增加,粗蛋白质表观消化率有先升高后降低趋势,KZ达到最大值且显著高于对照组(P<0.05)。随着两种产植酸酶菌添加量的增加,钙、磷的消化率皆有先升高后降低的趋势。钙表观消化率分别在YZ和KZ达到最大值且显著高于对照组(P<0.05)。以上结果表明:两种产植酸酶菌的添加能够促进全体和血清钙磷的沉积以及提高饲料表观消化率。4.产植酸酶E.cloacae和B.subtilis对牛蛙肠道组织结构的影响单因素方差分析结果显示,前肠:随着两种产植酸酶菌的增加,绒毛长度、绒毛宽度和肌层厚度皆呈现升高趋势。而肠上皮细胞高度并不受两种产植酸酶菌添加量的影响(P>0.05)。中肠:变化趋势与前肠相似。后肠:绒毛长度和绒毛宽度随两种产植酸酶菌添加量增加呈现先升高后降低趋势,分别在YZ和KZ达到最大值。肠上皮细胞高度随两种产植酸酶菌的添加,呈现上升趋势,在YG和KG达到最大值,YG显著高于对照组(P<0.05)。从牛蛙肠道组织学分析,两种产植酸酶菌的添加能够提高肠壁、绒毛完整性和前肠、中肠杯状细胞的数量,减少肠上皮细胞自溶现象。综合本试验结果,饲料中添加1×10~7-1×10~9cfu/g的E.cloacae和1×10~7 cfu/g的B.subtilis有利于维护牛蛙肠道健康。5.产植酸酶E.cloacae和B.subtilis对牛蛙肠道微生物菌群结构的影响两种产植酸酶菌的添加对牛蛙肠道OTUs有显著影响(P<0.05)。随着两种菌添加量的增加,OTUs皆呈现上升趋势,分别在YG和KZ时达到最大值且显著高于对照组(P<0.05)。两种产植酸酶菌添加显著提高了牛蛙肠道菌群的Alpha多样性指数(P<0.05),其分别在YG和KZ达到最大值且显著高于对照组(P<0.05)。7组样品的菌群组成在Phylum(门)的水平上,两种细菌的添加改变了优势菌群菌落(门水平)所占比例。随两种产植酸酶菌的添加,肠道内变形菌门所占比例也呈升高趋势且高于对照组。而厚壁菌门随这两种菌的添加呈先升后降趋势,分别在YZ和KZ达到最大比例。拟杆菌门在YD时高于其余各组,但随E.cloacae的添加水平增加,呈降低趋势,YG、B.subtilis添加组以及对照组皆低于YD、YZ。7组样品在Genus(属)水平上的菌群多样性丰富,随着两种产植酸酶菌添加量的逐渐升高,支原菌数量降低。随E.cloacae添加量增加,克雷伯氏菌属(Klebsiella)水平降低且低于对照组。乳球菌属在B.subtilis添加组中有增加趋势,且高于对照组。芽孢杆菌属(Bacillus)随B.subtilis添加量增加呈现升高趋势。本试验结果说明,添加E.cloacae和B.subtilis能够提高肠道微生物的丰度和多样性。在一定程度上可促进有益菌比例的增加,并抑制致病菌的增殖。