细胞内自由基检测的新型荧光探针的设计合成及应用

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在生命有机体的新陈代谢活动中,各种活性物质如活性氧、活性氮、活性氯分子以及各种小分子代谢物等参与能量传递和信号转导,对细胞的生理病理过程起着重要调节作用。有机体通过调节硫醇类物质和活性氧自由基的含量,维持内部氧化还原状态的相对稳定,避免氧化损伤、氧化应激和还原应激的发生。因此,对细胞内各种氧化性物质(如活性氧)所介导的氧化还原循环的研究具有重要的生物学意义。次氯酸(HOCl)是生物体内一种重要的活性分子。通常在髓过氧化物酶(MPO)的催化作用下,H2O2与Cl-发生反应而产生HOCl。HOCl被认为是一种具有自然抗菌能力的亲核性非自由基氧化剂,对细胞的生理功能有着重要影响。虽然基于荧光探针的荧光分析法已经用于细胞内HOCl的检测研究,但是目前尚无可以对HOCl进行可逆响应的荧光探针,由此从一定程度上限制了对HOCl参与的细胞内氧化还原循环的深入研究。过氧亚硝基阴离子(ONOO-)是生物有机体内一种极其重要的活性氧自由基。细胞内ONOO-是由O2-·和NO反应产生。ONOO-是一把双刃剑,它对有机体生物功能的影响既有有益的一面,也有不利的一面。利用荧光探针对ONOO-进行检测和识别已取得了较大进展。现已报道的对ONOO-有选择性响应的荧光探针中,能够实现专一可逆应答的还很少。所以设计一种对ONOO-具有专一可逆荧光响应的有机小分子荧光探针,对于研究细胞内ONOO-的生成、代谢及其相关的生理、病理机制具有重要意义。本论文基于可逆小分子荧光探针的设计合成及其细胞成像分析,开展了以下两部分研究:(一)用于可逆检测HOCl的新型荧光探针的设计合成及细胞成像研究氟硼二吡咯(BODIPY)是一种常见的荧光染料,在荧光探针研究中一般被作为探针母体,通过偶联识别基团构建探针。实验中我们发现其分子结构中的C=N双键可被Na2S2O4还原生成C-N单键,得到氢化产物。这种氢化产物能够选择性地被HOCl氧化,伴随荧光恢复,而此过程可以反复进行。在模拟生理条件下,我们以Br-BODIPY母体为荧光探针,实现了对Na2S2O4和HOCl的可逆荧光应答。探针选择性和光稳定性均令人满意。以小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)和HL-60细胞为生物模型,利用探针对HOCl的选择性可逆响应,实现了细胞内多个氧化还原循环的荧光成像。(二)用于检测ONOO-的新型近红外荧光探针的设计合成及细胞成像研究以近红外荧光染料Cy.7.Cl为母体,利用和硒同族的硫(S)的抗氧化性设计合成了一种新型近红外可逆有机小分子荧光探针。该探针对ONOO具有高效专一识别特性。在模拟生理条件下实现了探针对ONOO /GSH的可逆荧光应答。以小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)为生物模型,实现了细胞内ONOO的可逆氧化还原循环荧光成像检测。
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