背景:随着社会的飞速发展,人们在日常工作和生活中的压力越来越大,睡眠问题逐渐成为影响人们日常生活的主要问题之一。睡眠剥夺是指由于环境或者自身因素无法保证充足、连续的睡眠,从而导致精神倦怠、注意力无法集中、学习记忆能力下降等问题。睡眠剥夺对机体的不良影响已成为长期困扰人们的问题之一。藤茶,为葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang)的茎叶,具有清热利湿、平肝降压、活血通络的功效。现代药理研究表明藤茶具有多种药理活性,如抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂、保肝等。近年来,藤茶对神经系统的保护作用得到广泛关注。课题组前期研究表明急性睡眠剥夺可以引起小鼠学习记忆障碍,双氢杨梅素可以通过降低脑部氧化应激,抑制炎症因子和细胞凋亡,改善睡眠剥夺引起的神经损伤。本研究在此基础上进一步探讨藤茶对慢性睡眠剥夺的影响及作用机制,为藤茶改善睡眠剥夺认知损害方面的开发利用奠定科学基础。目的:(1)探讨藤茶及其主要成分双氢杨梅素对慢性睡眠剥夺模型小鼠学习记忆的改善作用及初步机制。(2)基于网络药理学探讨藤茶对神经系统的保护作用机制。(3)基于宏基因组测序技术,探究藤茶及其主要成分双氢杨梅素对慢性睡眠剥夺模型小鼠肠道菌群的调节作用。方法:(1)选用ICR小鼠为实验动物,采用改良多平台法建立慢性睡眠剥夺模型,分为正常组、模型组、双氢杨梅素高、低剂量组、藤茶高、低剂量组,通过旷场实验、新物体识别实验、水迷宫实验、避暗实验观察小鼠学习记忆相关行为学指标的改变,采用Elisa法检测小鼠海马和皮层中炎症因子水平,运用尼氏染色和免疫组化评价神经细胞及胶质细胞的形态变化,通过QPCR检测TLR4/MyD88/NF-κB通路上相关基因的表达。(2)基于TCMSP数据库、PubChem数据库,Metascape等在线分析系统筛选藤茶的有效成分及与神经精神类相关的疾病和靶点,制成“成分-靶点”及“靶点-疾病”网络图。利用String数据库绘制蛋白相互作用(PPI)网络,寻找关键靶点。(3)基于宏基因组测序技术,对慢性睡眠剥夺后小鼠肠道菌群的α多样性改变、菌群结构以及相对丰度进行分析。结果:(1)经过21天的睡眠剥夺及藤茶自由饮用、双氢杨梅素给药后,小鼠的自主活动及空间探索能力并未受到影响,与正常组相比,模型组小鼠在新物体识别实验中鉴别指数均显著降低,在Morris水迷宫中模型组小鼠寻找到平台的潜伏期显著增长,测试阶段穿越目标象限的时间、次数以及穿越平台的次数显著低于正常组;藤茶和双氢杨梅素干预后,小鼠在新物体实验、Morris水迷宫中的空间学习记忆能力明显提高。尼氏染色和免疫组化结果显示慢性睡眠剥夺小鼠神经细胞受损,海马区小胶质细胞和星形胶质细胞激活,Elisa和QPCR结果显示慢性睡眠剥夺小鼠海马区炎症因子IL-6、TNF-α以及NF-κB、MyD88、TLR4 mRNA的表达水平显著高于正常组,藤茶自由饮用及双氢杨梅素给药后神经细胞损伤得到修复,胶质细胞活化水平降低,TLR4/MyD88/NF-κB通路相关基因表达水平降低。(2)藤茶中黄酮类、酚类、挥发油类、甾体类化合物协同发挥神经保护作用,黄酮类化合物是发挥神经保护作用的主要成分。GO、KEGG富集分析结果表明,藤茶活性成分对应的靶点涉及突触信号传导、调节蛋白激酶活性,对活性氧的反应等生物过程,以及癌症通路、神经活性配体-受体相互作用通路、炎症通路、氧化应激通路等。PPI网络发现APP、TP53、HSP90AA1、MAPK1、AKT1等10个靶点可能是藤茶发挥神经保护作用的关键靶点。(3)慢性睡眠剥夺后不会对小鼠肠道菌群的α多样性造成影响,但调节了肠道菌群的结构及特定分类群的丰度。藤茶及其主要成分双氢杨梅素可以调节慢性睡眠剥夺组小鼠肠道菌群特定分类群的丰度,以乳杆菌属、优杆菌属等最为明显。结论:藤茶和双氢杨梅素可以通过减轻小鼠脑部炎症改善慢性睡眠剥夺所致的学习记忆障碍,其机制可能与TLR4/MyD88/NF-κB通路有关。网络药理学结果显示了藤茶多成分、多靶点的特点。藤茶发挥神经保护作用的机制涉及调节蛋白激酶活性、氧化应激、神经炎症等,提示对阿尔兹海默症、抑郁、双相情感障碍等可能具有潜在作用。慢性睡眠剥夺会引起肠道菌群紊乱,而藤茶及其主要成分双氢杨梅素可能同时通过调节肠道内特定的菌群,影响中枢神经系统以及炎症的发生,从而改善慢性睡眠剥夺引起的学习记忆障碍。