禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽急性呼吸系统疾病,可感染多种家禽和野生鸟类。禽流感病毒自发现以来,每年都有疫病流行的报道,目前在全球多个国家和地区呈大范围流行。其中,H5和H7亚型高致病性禽流感每次暴发都会给养禽业造成巨大的经济损失。H5和H7亚型禽流感病毒均有感染人的报道,对人类生命健康构成巨大威胁,严重危害公共卫生安全。因此,建立禽流感病毒高通量的快速检测和鉴定方法,对于开展禽流感疫情的监测预警和保障公共卫生安全具有重要意义。为了更快速准确的检测禽流感病毒,尤其是H5和H7亚型禽流感病毒,本研究在已有的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测方法的基础上,根据生产需求进一步优化,组成完整的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒制品,用制备的质控品对该试剂盒进行质量研究,并将该试剂盒用于大量临床样品检测,评价检测效果。为了对禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒进行质量研究,本研究选择了 14株不同亚型禽流感病毒株、1株新城疫病毒株、1株鸡传染性支气管炎病毒株、1株鸡传染性法氏囊病毒株、1株禽白血病毒株、1株禽网状内皮组织增生症病毒株和2只SPF鸡组织样品作为质控品,进行试剂盒质控品制备与鉴定。首先,对质控品制备工艺进行研究,确定最合适的灭活剂和冻干保护剂组合。结果显示,β-丙内酯与蔗糖脱脂乳作灭活冻干组合效果最佳,冻干品在4℃保存第7 d、30 d、90 d分别检测,结果无明显差异;其次,将所有毒株进行培养、灭活、冻干,并用已公布的特异性荧光检测引物进行鉴定;选择1株H5亚型禽流感病毒株和1株H7亚型禽流感病毒株作为敏感性质控品并进行标定,用对应的引物探针检测结果为阳性,且未出现非特异性扩增,禽流感病毒通用检测引物探针检测敏感性质控品H7-2强阳性Ct值为25.296±0.981,H5亚型禽流感病毒强阳性Ct值为25.439±1.161,H7亚型禽流感病毒强阳性Ct值为27.658±1.020;将其余的毒株作为特异性质控品,用对应的引物探针检测结果为阳性,且未出现非特异性扩增;最后,将2只SPF鸡的血清、匀浆液上清和拭子作为阴性质控品,鉴定结果均为阴性。制备的敏感性质控品、特异性质控品和阴性质控品能满足禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒质量研究的需要。为了检验禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒的质量是否符合标准,做了以下研究:（1）敏感性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒按照试剂盒说明书对敏感性质控品、特异性质控品、阴性质控品、45份H5亚型禽流感病毒阳性临床样品和45份H7亚型禽流感病毒阳性临床样品进行检测,同时用OIE推荐或论文公开发表的检测方法进行平行试验,与标准方法检测结果符合率为100%;将敏感性质控品H5-2 和 H7-2 用 PBS 进行 10 倍梯度稀释,选择 101、102、103、104、105、106、107、108倍稀释度样品提取核酸,用禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测,每个稀释度做20个重复,确定检测结果中阳性检出率刚好大于等于95%时的样品稀释度,该稀释度即为对应亚型的最低检出量,对应的Ct值即为阳性判定标准。结果显示,检测禽流感病毒通用型的引物探针对敏感性质控品H7-2的最低检测限为107倍稀释度,Ct值为37.614±0.250,检测H5亚型禽流感病毒的引物探针对敏感性质控品H5-2的最低检测限为106倍稀释度,Ct值为37.736±0.210,检测H7亚型禽流感病毒的引物探针对敏感性质控品H7-2的最低检测限为107倍稀释度,Ct值为37.833±0.312;（2）特异性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒对敏感性质控品、特异性质控品、阴性质控品和60份阴性临床样品进行检测,3批试剂盒检测均未出现异常扩增曲线;（3）重复性研究:分别用3个批次的禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒检测敏感性质控品,敏感性质控品需进行10倍梯度稀释至最低检出限,每个稀释度做3个重复,批内平均变异系数为1.31%,批间平均变异系数为1.84%,批内批间变异系数均小于3%。结果证明禽流感病毒（通用、H5、H7）三重荧光RT-PCR检测试剂盒敏感性、特异性和重复性均较好。为了在实际应用的条件下评估禽流感病毒（通用、H5、H7）荧光RT-PCR检测试剂盒的临床适用性,本试验用试剂盒对4个省份活禽交易市场1920份拭子样品进行检测。结果显示,禽流感病毒阳性样品775份,其中61份为H5亚型禽流感病毒,6份为H7亚型禽流感病毒。由此说明,试剂盒可以用于禽流感病毒临床检测,既能检出禽流感病毒,同时可以区分H5和H7亚型高致病性禽流感病毒,能够满足临床检测需求。