【摘 要】
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目的:ASCT2（编码基因SLC1A5）是一种以谷氨酰胺为首选底物、Na+依赖性的中性氨基酸转运蛋白,可将谷氨酰胺运至细胞内提供能量,在许多组织中高表达,癌细胞中广泛检测出该基因高表达。许多研究发现,敲低SLC1A5基因后,可抑制癌细胞的生长。另一方面,小分子抑制剂V-9302是一种竞争性的跨膜谷氨酰胺通量的拮抗剂,能选择性地靶向氨基酸转运体ASTC2,目前,其作用正处于临床前试验阶段,V-930
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目的:ASCT2（编码基因SLC1A5）是一种以谷氨酰胺为首选底物、Na+依赖性的中性氨基酸转运蛋白,可将谷氨酰胺运至细胞内提供能量,在许多组织中高表达,癌细胞中广泛检测出该基因高表达。许多研究发现,敲低SLC1A5基因后,可抑制癌细胞的生长。另一方面,小分子抑制剂V-9302是一种竞争性的跨膜谷氨酰胺通量的拮抗剂,能选择性地靶向氨基酸转运体ASTC2,目前,其作用正处于临床前试验阶段,V-9302作用浓度为25μmol/L时可以导致大部分肺、肠、乳腺癌细胞系生长和增殖抑制,细胞凋亡增多,并且细胞的氧化应激压力增强。本研究从两部分入手,旨在发现SLC1A5与AML的发生有相关性,探察其在AML细胞系KG-1、HL-60中的作用机制;发现V-9302可以促进AML细胞系KG-1、HL-60的凋亡,也许可以作为靶向药物应用于临床,用于提高AML的治愈率以及降低复发率。材料和方法:本研究主要分为两大部分。第一部分:先使用生物信息学方法,从TCGA数据库中挖掘AML的原始m RNA表达数据,共收集151份肿瘤标本,从GTEX数据库收集对应的正常标本共337份,使用limma包normalize函数进行芯片矫正。使用wilcox检验探讨两者之间该基因的表达差异,使用Kaplan-Meier方法进行生存分析,p<0.05认为有显著性意义。分析SLC1A5基因表达差异,以及该基因表达差异所导致的生存分析差异。从临床收集正常人或骨髓非恶性疾病病人的骨髓样本作为对照组,收集AML初治或复治病人骨髓样本作为实验组,通过提取骨髓样本的RNA,逆转录为c DNA,使用q-PCR技术,探究SLC1A5基因的表达差异,对比数据库分析资料,进一步证实该基因与AML的发生有关。在AML细胞系KG-1及HL-60中使用慢病毒质粒构建SLC1A5敲低的稳转株,通过CCK-8、流式细胞术、western blot等技术分析该基因对于两个细胞系增殖、代谢、氧化应激、凋亡等方面的作用,并探究其作用机制。第二部分:使用小分子抑制剂V-9302,通过CCK-8、流式细胞术、q-PCR、western blot等技术探究其在AML细胞系KG-1及HL-60中的作用。结果:第一部分:生物信息学分析发现SLC1A5相对于正常人,在AML病人中存在高表达,且该基因的高表达与生存有关,我们的AML病人临床数据分析证实了这一结论。在使用慢病毒质粒构建的SLC1A5敲低的AML细胞系KG-1及HL-60稳转株中,相对于SLC1A5正常表达的KG-1及HL-60细胞而言,随着时间的增加,其增殖活性逐渐降低,48h后,KG-1及HL-60细胞内的ROS表达水平增加,而细胞内GSH表达下降,氧化应激水平增强,且能明显观察到细胞自噬增多,最终共同作用下导致细胞凋亡增多,线粒体凋亡通路被激活,这些现象的产生和m-TOR信号通路被抑制所导致的细胞内能量代谢水平下降,能量缺乏所致。第二部分:V-9302作用于AML细胞系HL-60、KG-1后,细胞活力明显受到抑制,并且呈剂量依赖性,同时,V-9302促进HL-60、KG-1凋亡,其作用于细胞后可增加促凋亡相关蛋白BAX、Caspase3活化片段cleavedCaspase3的表达水平,而抗凋亡相关蛋白BCL2表达下降,BCL2/BAX比值降低,证实其可能通过激活线粒体凋亡通路,引起HL-60、KG-1凋亡。结论:SLC1A5高表达与AML的进展有关,敲低SLC1A5可通过抑制mTOR信号通路介导的能量代谢水平的下降来抑制AML细胞的生长和增殖;使用竞争性的跨膜谷氨酰胺通量的拮抗剂V-9302可促进AML细胞的凋亡,抑制AML的进展。
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