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目的:针对排卵障碍为女性不孕症的主要原因这一问题,本课题组在前期研究证实补肾法、疏肝法均可调节卵巢功能、促进卵泡发育、诱发排卵的基础上,研究补肾法、疏肝法诱发排卵与孕激素受体(progestrone receptor,PR)调节卵泡破裂路径的关系,以期揭示补肾法、疏肝法诱发排卵的作用及其机制,丰富中医生殖理论。方法:1.大鼠含药血清制备取40只6周龄健康雌性SD大鼠,制备得补肾调经Ⅱ号方高剂量、补肾调经Ⅲ号方高剂量、逍遥丸高剂量、逍遥丸低剂量含药血清和正常大鼠血清。2.窦前卵泡的体外培养选用出生D10的昆明乳鼠,随机分为4组:空白组、正常组、补肾组、疏肝组。采用机械法分离窦前卵泡。三气培养箱中普通培养法培养。序贯加入补肾调经Ⅱ、Ⅲ号方高剂量或逍遥丸高、低剂量大鼠含药血清,为补肾组和疏肝组,加正常大鼠血清为正常组,不加血清为空白对照组,培养12天,隔天换液。培养D12:观察、测量卵泡和卵母细胞直径。加入hCG后16 h,观察卵泡成活率、窦腔形成率和卵母细胞逸出率。细胞免疫荧光染色法检测卵泡和卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)中氧化物酶体增殖剂激活型受体(peroxisome roliferator-activated receptor,PPAR)γ、乏氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)、去整合素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease)家族中的ADAMTS-1、ADAM 8和内皮素-2(endothelin-2,ET-2)蛋白表达;实时荧光定量PCR法检测上述指标mRNA表达。结果:1卵泡生长过程中形态及结构变化体外培养D1,卵泡贴壁于培养皿底部;D4卵泡直径明显增大;D8部分卵泡形成窦腔,颗粒细胞区见透明区;D12卵泡直径、窦腔增大,卵泡内可见COCs;D12加入h CG 16h后,COCs排出,卵母细胞逸出,并可见极体排出。2体外培养D12加入hCG 16h后各组卵泡和卵母细胞直径、卵泡成活率、窦腔形成率和卵母细胞逸出率的比较卵泡直径比较:空白组与正常组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);与空白组和正常组比较,补肾组和疏肝组均增大(P<0.05),补肾组优于疏肝组(P<0.05)。卵母细胞直径比较,各组间均无统计学意义(P>0.05)。卵泡成活率的比较:空白组与正常组之间比较,无统计学意义(P>0.05);与空白组和正常组比较,补肾组和疏肝组卵泡成活率均升高(P<0.05),补肾组高于疏肝组(P<0.05)。窦腔形成率及卵母细胞逸出率的比较:空白组与正常组之间比较,无统计学意义(P>0.05);与空白组和正常组比较,补肾组和疏肝组均升高(P<0.05),补肾组高于疏肝组(P<0.05)。3各组体外培养卵泡和排出的COCs中PR-A、PPARγ、ADAMTS-1、ADAM8、HIF-1α、ET-2蛋白的表达3.1体外培养D12加入hCG后不同时间各组内点PR-A、PPARγ、ADAMTS-1、ADAM 8、HIF-1α、ET-2蛋白的表达空白组:与0 h比较,8 h PPARγ、ADAMTS-1、ADAM 8、HIF-1α、ET-2蛋白表达均无统计学意义(P>0.05),PR-A蛋白表达升高(P<0.05);与8 h比较,12 h各指标蛋白表达均无统计学意义(P>0.05);与12 h相比,16 h各指标蛋白表达均无统计学意义(P>0.05)。正常组:与0 h比较,8 h各指标蛋白表达之间差异无统计学意义(P>0.05);与8 h比较,12 h PPARγ、ADAMTS-1、HIF-1α、ET-2蛋白表达无统计学意义(P>0.05),PR-A、ADAM 8蛋白表达升高(P<0.05);与12 h相比,16 h各指标蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。补肾组:0 h、8 h、12 h、16 h各指标蛋白表达呈逐渐增高趋势,8 h PR-A、ADAMTS-1、HIF-1α的表达均升高(P<0.05),PPARγ、ADAM 8、HIF-1α、ET-2表达升高,但无统计学意义(P>0.05);与0 h、8 h相比,12 h、16 h各指标蛋白表达均升高(P<0.05),12 h、16 h之间无统计学意义(P>0.05)。疏肝组:0 h、8 h、12 h、16 h各指标蛋白表达呈逐渐增高趋势。与0 h比较,各指标蛋白表达均增强(P<0.05);与8 h相比,12 h、16 h蛋白表达升高,但均无统计学意义(P>0.05),12 h、16 h之间无统计学意义(P>0.05)。3.2培养D12加入hCG后同一时间点各组间PR-A、PPARγ、ADAMTS-1、ADAM 8、HIF-1α、ET-2蛋白的表达0 h:空白组、正常组、补肾组、疏肝组各组间PR-A、PPARγ、ADAMTS-1、ADAM 8、HIF-1α、ET-2蛋白表达均无统计学意义(P>0.05)。8 h:与空白组比较,正常组各指标蛋白表达无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,补肾组与疏肝组PR-A、PPARγ、ADAM 8、HIF-1α、ET-2蛋白表达均升高(P<0.05),疏肝组高于补肾组(P<0.05);补肾组与空白组和对照组之间ADAMTS-1蛋白表达无统计学意义(P>0.05),疏肝组高于补肾组(P<0.05)。12 h:与空白组比较,正常组各指标蛋白表达无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,补肾组与疏肝组各指标蛋白表达均升高(P<0.05),补肾组高于疏肝组(P<0.05)。16 h:与空白组比较,正常组各指标蛋白表达无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,补肾组与疏肝组蛋白表达均升高(P<0.05);补肾组与疏肝组PR-A、PPARγ、ADAMTS-1、ADAM 8、HIF-1α蛋白表达之间均无统计学意义(P>0.05),补肾组ET-2蛋白表达高于疏肝组(P<0.05)。4各组体外培养卵泡或排出的COCs中PR-A、PPARγ、ADAMTS-1、ADAM8、HIF-1α、ET-2 mRNA的表达4.1培养D12加入hCG后不同时间点各组内PR-A、PPARγ、ADAMTS-1、ADAM 8、HIF-1α、ET-2 mRNA的表达空白组:0 h、8 h、12 h、16 h各指标mRNA表达呈逐渐增高趋势。与0 h比较,8 h PR-A、PPARγ、ADAMTS-1的表达升高(P<0.05),ADAM 8、HIF-1α、ET-2表达有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05);与0 h、8 h相比,12 h、16 h各指标mRNA表达均升高(P<0.05),12h、16 h之间差异无统计学意义(P>0.05)。正常组:0 h、8 h、12 h、16 h之间各指标mRNA表达呈逐渐增高趋势。与0 h比较,8 h无统计学意义(P>0.05);与0 h、8 h相比,12h、16 h各指标mRNA表达均升高(P<0.05),12 h、16 h之间无统计学意义(P>0.05)。补肾组:0 h、8 h、12 h、16 h之间各指标mRNA表达呈逐渐增高趋势。与0 h比较,8 h各指标mRNA表达无统计学意义(P>0.05);与0 h、8 h相比,12 h、16 h各指标mRNA表达均升高(P<0.05),12 h、16 h之间无统计学意义(P>0.05)。疏肝组:0 h、8 h、12 h、16 h mRNA表达呈逐渐增高趋势。与0 h比较,8 h各指标mRNA表达均升高(P<0.05);与8 h相比,12 h、16h各指标mRNA表达有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05),12 h、16 h之间无统计学意义(P>0.05)。4.2培养D12加入hCG后同一时间点各组间PR-A、PPARγ、ADAMTS-1、ADAM 8、HIF-1α、ET-2 mRNA的表达0 h:与空白组比较,正常组各指标mRNA表达无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,补肾组与疏肝组各指标mRNA表达均升高,但无统计学意义(P>0.05);补肾组与疏肝组之间无统计学意义(P>0.05)。8 h:与空白组比较,正常组各指标mRNA表达无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,补肾组与疏肝组各指标mRNA表达均升高(P<0.05),疏肝组高于补肾组(P<0.05)。12 h:与空白组比较,正常组各指标mRNA表达无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,补肾组与疏肝组各指标mRNA表达均升高(P<0.05),补肾组高于疏肝组(P<0.05)。16 h:与空白组比较,正常组各指标mRNA表达无统计学意义(P>0.05);与空白组和对照组比较,补肾组与疏肝组各指标mRNA表达均升高(P<0.05);补肾组各指标mRNA表达均高于疏肝组,但无统计学意义(P>0.05)。结论:1.补肾调经Ⅱ、Ⅲ号方和逍遥丸含药血清可促进体外培养小鼠卵泡生长发育,诱发排卵。2.补肾法和疏肝法均可上调卵泡和COCs中PR及其调节的卵泡破裂相关因子PPARγ、ADAMTS-1、ADAM 8、HIF-1α、ET-2蛋白及其m RNA的表达,从而诱发排卵。3.补肾法和疏肝法诱发排卵的机制相同而时点不同,补肾法在排卵时、疏肝法排卵前发挥促进作用,补肾法诱发排卵的作用优于疏肝法。