【摘 要】
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β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)属于糖苷水解酶类,它可以水解乳糖,生成半乳糖与葡萄糖。β-半乳糖苷酶是一类被众多权威机构认定为安全无毒的生物酶制剂,该酶可以广泛应用在医药、食品、环境保护和基因工程等方面。在食品和医药领域,通过水解食物中的乳糖,可使乳糖不耐受症状得到缓解,为人们生活水平的提高起到了极大的帮助作用。为了获得高产β-半乳糖苷酶的菌株方便其在工业中应用,本文人工合成了一个来源于米曲
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β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)属于糖苷水解酶类,它可以水解乳糖,生成半乳糖与葡萄糖。β-半乳糖苷酶是一类被众多权威机构认定为安全无毒的生物酶制剂,该酶可以广泛应用在医药、食品、环境保护和基因工程等方面。在食品和医药领域,通过水解食物中的乳糖,可使乳糖不耐受症状得到缓解,为人们生活水平的提高起到了极大的帮助作用。为了获得高产β-半乳糖苷酶的菌株方便其在工业中应用,本文人工合成了一个来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-半乳糖苷酶基因Aogal,并将其转入毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行表达;通过ONPG法测定其活性,表达载体p AO815-Aogal经诱导表达后,菌株中活性最高的是89.16 U/m L;对酶学性质进行测定表明,p AO815-Aogal的最适温度60°C,最适p H 5.0,在30°C、40°C和50°C孵育30 min后,酶活性仍可保留80%以上。为提高Aogal的表达量,本研究在对Aogal的密码子偏好性进行分析后,重新构建了表达载体p AO815-Aogal-1,经密码子偏好性优化后Aogal-1酶活最高为196.76 U/m L,比原基因提高了2倍左右,且在优化后Aogal-1的最适p H和温度均未发生改变。在对密码子偏好性的优化后,又尝试通过搭桥法对Aogal-1进行定点突变以获得更高产量的菌株,但当经过发酵诱导后,目的蛋白虽表达成功,但蛋白表达量未得到明显提升,且酶活低至12.90 U/m L。本研究进一步通过同尾酶法构建了β-半乳糖苷酶Aogal-1的二拷贝和三拷贝表达载体。其中一拷贝表达菌株的平均酶活117.04 U/m L,二拷贝表达菌株的平均酶活210.07 U/m L,比一拷贝菌株提高了44.28%;三拷贝表达菌株的平均酶活403.01U/m L,比一拷贝表达菌株酶活提高70.96%。将二拷贝表达酵母菌株B-3高密度发酵,酶活在诱导24-96 h之间增长迅速,然后渐渐趋于平稳;在诱导72 h后酶活4044.61U/m L,是原摇瓶发酵72 h时的11.02倍;诱导结束后,该菌株发酵酶活达到6335.39U/m L。
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