【目的】碳青霉烯类耐药菌（Carbapenem-resistant organism,CRO）因临床高感染率和病死率而备受关注,控制CRO的关键在于早期发现携带者和感染患者,采取相应的感染防控措施。碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE）是重要的CRO,其定植和宿主免疫功能受损是感染和死亡的独立危险因素。本研究旨在通过分析CRE肠道定植菌株与临床感染菌株的同源性,追踪和溯源CRE肠外感染的发生,分析定植菌株的细菌特征与后续感染的相关性以及宿主淋巴细胞功能在感染发生发展过程中的变化,为采取防控措施以预防后续感染提供理论基础,降低临床感染的发生率和病死率。【方法】一.CRE定植菌株与CRE感染菌株的同源性研究采集重症医学科（Intensive care unit,ICU）和血液内科住院高危患者的直肠拭子,用肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase,KPC）显色琼脂筛选平板进行CRE定植筛查,常规方法检测CRE感染。招募合并CRE定植和CRE感染的患者,收集患者的定植菌株和感染菌株,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行菌种鉴定、微量肉汤稀释法进行抗菌药物敏感性试验、聚合酶链式反应分析碳青霉烯酶型别、多位点序列分型技术分析菌株型别,以及脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gel electrophoresis,PFGE）技术和全基因组测序（Whole genome sequencing,WGS）技术分析定植菌株和感染菌株的亲缘关系,结合患者临床信息,研究CRE定植与感染的关系。二.CRE定植患者发生CRE感染的风险评估及预测模型建立招募重症医学科CRE定植患者,收集患者的临床资料和定植菌株的微生物学信息,包括查尔森合并症指数（Charlson Comorbidity Index,CCI）评分、免疫抑制剂使用、侵入性诊疗、抗菌药物治疗、定植菌株的菌种、抗菌药物耐药表型、碳青霉烯酶型别等。根据患者住院期间是否发生后续CRE感染进行分组,采用倾向性评分匹配（Propensity score matching,PSM）法进行病例匹配。通过单因素分析筛选发生后续感染的相关危险因素,根据二元logistic回归分析建立感染风险预测模型以评估ICU住院患者在CRE定植后继发CRE感染的风险。三.宿主淋巴细胞功能与CRE定植和CRE感染的相关性分析招募阴性对照患者（CRE筛查阴性患者）、CRE定植患者和CRE感染患者。当CRE筛查为阴性/阳性,或感染患者检出CRE后,立即采集患者外周血,通过流式细胞技术检测淋巴细胞的数量及干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）分泌功能,同时收集患者的临床资料,包括入院史、CCI评分、免疫抑制剂使用、侵入性操作和抗菌药物暴露等。采用PSM对病例进行匹配后,分析组间淋巴细胞的数量和IFN-γ分泌功能,以及临床因素与CRE定植和感染之间的关系。四.CRO感染患者不良预后的风险评估及预测模型建立招募CRO感染患者,当患者检出CRO后立即采集外周血,通过流式细胞技术检测淋巴细胞的数量及IFN-γ分泌功能,同时收集患者临床资料、常规实验室检查和微生物学相关信息,包括急性生理与慢性健康评分（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II,APACHE II）、免疫抑制剂使用、侵入性操作、抗菌药物治疗、血常规、肝肾功能、CRE定植、感染类型和合并感染等。根据患者30天结局进行分组,通过单因素分析筛选30天死亡的相关危险因素,根据二元logistic回归分析建立死亡风险预测模型,以在CRO感染早期识别预后不良的高危患者。【结果】一.CRE定植菌株与CRE感染菌株的同源性研究2018年5月至2019年1月,ICU和血液内科合并CRE定植和CRE感染的患者31例,收集定植菌株62株、感染菌株33株。根据31例患者的菌种、碳青霉烯酶型别、序列型（Sequence type,ST）型别和抗菌药物耐药表型,选取10例患者进行PFGE（42株分离菌）和WGS（32株分离菌）分析。PFGE将42株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP）分为11簇,耐药基因聚类分析将32株CRKP分为2大分支,单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）系统发生树分为5簇。结合患者临床信息,分析结果显示,1号患者定植菌株和感染菌株高度同源,但抗菌药物耐药表型和耐药基因型存在差异,2号、3号和4号患者各定植菌株间存在差异。5号和10号为定植后感染患者,定植菌株和感染菌株高度同源。8号和9号患者先分离感染菌株,后检出定植菌株,二者亦高度同源。6号和7号患者分离的定植菌株和感染菌株亲缘关系较远,且6号患者临床感染标本中检出两种CRKP菌株。二.CRE定植患者发生CRE感染的风险评估及预测模型建立2018年5月至2020年8月,ICU住院患者CRE定植率为8.9%,定植患者感染率为11.0%。经3:1的病例匹配,纳入108例CRE定植患者,其中,未发生CRE感染的对照组81例,发生CRE感染的感染组27例。感染组中携带blaKPC、亚胺培南（Imipenem,IPM）最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）MICIPM≥32μg/ml和厄他培南（Ertapenem,ETP）MIC值MICETP≥64μg/ml的定植菌株占比高于对照组。联合临床因素和微生物因素进行多因素分析后,机械通气（校正优势比[Adjusted odds ratio,a OR],5.044;95%置信区间[Confidence interval,CI],1.114-22.832;P=0.036）、手术（a OR,5.764;95%CI,1.718-19.332;P=0.005）、β-内酰胺酶抑制剂（a OR,0.141;95%CI,0.042-0.465;P=0.001）和blaKPC（a OR,5.133;95%CI,1.598-16.493;P=0.006）与CRE定植患者发生CRE感染独立相关。受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）分析显示联合模型优于仅纳入临床因素或微生物因素的模型。取cut-off值0.501时,联合模型预测准确性、敏感性和特异性分别为86.11%、63.0%和93.8%。三.宿主淋巴细胞功能与CRE定植和CRE感染的相关性分析2018年11月至2020年8月,进行病例匹配后纳入阴性对照患者、CRE定植患者和CRE感染患者各60例。分析发现,对照组和定植组间以及定植组和感染组间的淋巴细胞数量差异无统计学意义。定植组的NK细胞IFN-γ分泌功能显著低于阴性对照组（P<0.001）,感染组CD4+T细胞和CD8+T细胞IFN-γ分泌功能均低于定植组（P=0.002,P=0.040）。对照组和定植组间免疫抑制剂使用、白细胞计数、中性粒细胞计数,以及抗菌药物暴露史差异具有统计学意义。除上述因素外,定植组与感染组间入院史、转科、胃肠道损伤、透析和多种侵入性操作史的差异也具有统计学意义。四.CRO感染患者不良预后的风险评估及预测模型建立2018年11月至2019年8月,纳入CRO感染患者127例,包括存活组85例、死亡组42例。死亡组患者淋巴细胞数量和IFN-γ分泌功能显著降低。IFN-γ+CD4+T细胞计数能有效预测CRO感染患者30天预后,其ROC曲线下面积、敏感性、特异性和准确性分别为0.889（95%CI,0.834-0.945）、81.0%、80.0%和80.3%。实验室指标的多因素分析中,纳入IFN-γ+CD4+T细胞计数和肌酐浓度构建的2指标预测模型,可在感染早期预测患者预后,其ROC曲线下面积、敏感性、特异性和准确性分别为0.894（95%CI,0.841-0.947）、83.3%、82.4%和82.7%。【结论】1.ICU和血液内科住院高危患者肠道可存在CRE多克隆定植,且呈动态变化。CRE定植和肠外感染关系复杂,感染可能来源于定植菌株,也可能与定植菌株无关。此外,CRE感染患者可转归为CRE肠道定植。2.当CRE定植患者的定植菌株携带blaKPC、MICIPM≥32μg/ml或者MICETP≥64μg/ml时,患者发生后续CRE感染的风险更高。联合临床因素和微生物因素构建的预测模型,能够较好地预测ICU住院患者在CRE定植后继发CRE感染的风险。3.CRE定植可能与患者天然免疫功能受损相关,而进一步的获得性免疫功能受损可能与CRE感染发生相关。CRE感染过程中,淋巴细胞功能出现不同程度的下降,其变化趋势和程度可反映机体免疫状态和疾病进展。4.淋巴细胞数量降低和功能受损是影响CRO感染患者预后的关键因素,IFN-γ+CD4+T细胞计数可有效预测CRO感染患者30天预后,并在监测预后方面具有潜在价值。基于IFN-γ+CD4+T细胞计数和肌酐浓度构建的2指标预测模型,不仅可以很好地预测患者预后,在治疗过程中对预后的监测也具有潜在价值。