畜禽传染病一直严重制约着畜牧业发展。疫苗预防依然是当前畜禽传染病防制的主要措施。而绝大多数疫苗需要在免疫促进剂的辅助下才能发挥良好的功效。因此,研究安全有效的新型免疫增强剂已成为亟待解决的问题。骨髓是重要的造血器官,也是免疫细胞的形成场所。胸腺被公认为是细胞免疫中枢,且为鸟类和哺乳动物所共有。在哺乳动物体内,骨髓是中枢体液免疫器官,但其只能作为类囊器官。法氏囊是目前广泛认可的、鸟类特有的体液中枢免疫器官,对B细胞的发育成熟具有重要作用。近年来,从法氏囊中分离到多种不同活性肽,并验证具有免疫调节作用机制。然而目前对法氏囊来源的活性分子调节B细胞发育及其机制的报道比较少。临床应用发现,法氏囊组织来源的灭活疫苗的保护效果远远超过细胞源和鸡胚源的同类疫苗,暗示了法氏囊中存在活性分子参与了疫苗的免疫反应。研究体液免疫系统中、促进疫苗免疫保护效果的活性分子对当前临床疫病防治具有重要指导意义。本研究首先分离纯化出了两种新型法氏囊活性肽,并对其和另一种近期报道的法氏囊活性肽BHP对疫苗免疫调节作用进行了研究,然后采用基因芯片的技术和实时定量PCR等技术对其调节B细胞的分子机制进行了研究和验证。本研究主要内容包括:1新的法氏囊多肽分离、纯化和鉴定以500g健康鸡法氏囊组织为原料,经过冷冻、超声、离心、分子筛和反相高效液相色谱以及质谱等过程,分离纯化到两种新的法氏囊活性肽,并测定其氨基酸顺序分别为BP9(LMTFRNEGT)和BP7(GGCDGAA),丰富了法氏囊活性肽库资料,为进一步研究奠定了基础。NCBI中查找BP7和BP9的同源蛋白发现,BP9与干扰素-γ诱导的溶酶体巯基还原酶和细胞因子信号传导抑制因子7等同源,BP7与干扰素诱导的解旋酶C结构域蛋白1(IFIH1)和免疫球蛋白重链可变区等同源。这些数据暗示这两种新分离的多肽可能参与了机体中免疫反应及其他生物学功能。2法氏囊活性肽的免疫调节作用的研究为了探讨新分离法氏囊多肽在哺乳动物体内的免疫调节活性,BP9和BHP联合JEV灭活疫苗、BP7联合AIV疫苗或抗原免疫4周龄ba1b/c小鼠,并检测小鼠血清中抗体水平变化、脾脏淋巴细胞增殖、T细胞分型等指标。结果显示,1、BHP免疫组免疫四周后促进抗原特异性抗体抗体水平明显升高,且0.25mg/mL组抗体水平最高,而且自免疫后2周,O.01mg/mL和0.25mg/mL BHP免疫组IgG2a抗体水平明显升高,而直到免疫后6周,IgG1抗体水平明显升高,且在实验浓度范围内,0.25mg/mLBHP免疫组反应水平最高。而且,在实验浓度范围内,BHP免疫组明显促进JEV中和抗体水平和IFN-γ水平产生,而IL-4变化不明显。这些结果暗示BHP作用前期主要针对Th1型反应,后期专注于Th2型反应,即在JEV疫苗联合免疫期间,BHP促进了 Th1和Th2型免疫反应的转换。此外,BHP免疫组明显促进T细胞亚型CD4+与CD8+T细胞分化,并促进淋巴细胞增殖。这些证实BHP能促进疫苗免疫中抗体反应和细胞免疫反应。2、BP9联合JEV疫苗免疫时,JEV特异的抗体和IgG1和IgG2a抗体水平明显升高,且中和抗体水平也显著升高,而且各种抗体水平随着BP9剂量增加而水平降低。虽然BP9免疫明显促进淋巴细胞活力但T细胞亚型没有明显变化,除了 0.01 mg/mLBP9免疫组CD4+T细胞百分率降低。3、在AIV疫苗和AIV抗原免疫实验中发现,BP7在两种免疫模型中发挥了不同的免疫调节作用。BP7联合AIV疫苗免疫组,抗体没有明显变化。而AIV抗原联合免疫组,只有在4周时,10和50μg/mLBP7促进抗体水平升高,不过可以看出,随着BP7剂量增加,抗体水平逐渐降低。抗体亚型IgG1和IgG2a检测发现,IgG1是主要的抗体亚型。疫苗免疫组,IgG1抗体水平没有明显变化,不过IgG2a抗体水平随着BP7剂量增加而降低;而AIV抗原免疫组,10μg/mLBP7免疫组IgG1明显高于抗原对照组,而50和250μg/mLBP7免疫组IgG1抗体水平则低于抗原对照组,不过三个剂量BP7免疫组的IgG2a抗体均明显高于抗原对照组。此外,BP7联合AIV抗原免疫组主要刺激IL-4产生,且明显调节淋巴细胞活力,而联合疫苗免疫组则主要刺激IFN-γ产生,且对淋巴细胞活力影响不大。这些结果暗示BP7是一种多功能的活性分子,在AIV疫苗和抗原免疫免疫模型中发挥了不同的免疫调节功能。实验结果表明,三种法氏囊活性肽对哺乳动物同样具有免疫调节活性,不过其免疫活性与免疫剂量等因素有关,且其发挥作用的方式也有一定差异。3法氏囊活性肽对小鼠B细胞的作用机理研究本研究以小鼠未成熟B淋巴细胞WEHI231细胞为模型,首先采用MTT法测定多肽BHP、BP9和BP7对WEHI231细胞增殖活力的影响,结果显示,BHP和BP9对WEHI231细胞的增殖具有抑制效果,且表现一定的剂量依赖性,而BP7对细胞增殖活力影响甚微。然后采用小鼠转录组基因芯片技术检测0.01μg/mLBHP、0.01μg/mLBP9和0.1μg/mLBP7刺激后细胞基因表达变化情况。基因芯片结果显示,BHP、BP9和BP7分别导致1539个、2602个和2465个基因表达变化。经过通路分析和GO功能分析发现,这些变化基因涉及众多通路和多种生物学过程,包括免疫相关过程、细胞自噬、细胞迁移以及细胞代谢等。Pathway互作分析结果显示BHP刺激WEHI231细胞后,差异表达的基因涉及到多种生理代谢通路和信号转导通路,包括柠檬酸循环、糖酵解糖异生、p53和mTOR信号通路等。BP9刺激后,差异表达基因涉及的通路中,内吞及泛素化介导的蛋白水解与其余通路关系最密切。BP7刺激后,泛素介导的蛋白水解和抗原递呈是主要的通路。GO功能分析发现,BHP主要影响T、B淋巴细胞活化以及免疫进程相关GO条目;BP9主要涉及T细胞活化、细胞因子分泌和MHC分子以及泛素化相关过程;BP7则对抗原递呈以及淋巴细胞增殖有重要影响。这些结果揭示了法氏囊活性肽BHP、BP9和BP7调节免疫诱导的作用机制。综上所述,新法氏囊活性肽具有疫苗免疫增强效果,由于其影响B细胞的众多生物学过程,在法氏囊中其必然担当重要角色。对其作用机理的深入研究,有助于阐述B细胞分化发育过程,还有助于认识机体正常的生理代谢过程以及与之相关的多种遗传性、代谢性疾病等,对临床应用研究具有指导意义。