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猪流性腹泻病毒(PEDV)是引发猪流行性腹泻病(PED)的主要病原之一。2010年末,PED在中国多省市暴发,引发数以百万计的仔猪死亡,同时,该病同样在亚洲其他国家、美洲国家及欧洲国家广泛流行,其造成的经济损失难以估计。同时,临床流行病学研究发现,即使在疫苗免疫猪场,仍呈现了高水平的感染率和死亡率。为了解河南地区当前PEDV的遗传变异情况,本研究根据GeneBank中PEDV经典CV777株的全序列设计了20对特异性引物,采用RT-PCR方法对采集自河南省开封某猪场的PEDV流行株CH-HNKF-15的全基因组进行分段扩增、克隆和测序,并获得了CH-HNKF-15基因组的完整序列,其基因组中除去Poly(A)共有28038bp。进一步对本研究毒株进行全基因的序列分析,结果显示,除ORF3基因外,其余各编码基因的遗传进化分析显示,本研究毒株与经典毒株CV777、中国早年分离株CH-S、LZC及韩国DR13弱毒株均不处于一个进化分支。从全基因核苷酸相似性来看,本研究毒株与CV777株存在3.3%的差异,其中以S基因突变最为显著。在上述研究基础上,笔者对2014~2015年间采自河南省16地市不同猪场的30株疑似PEDV阳性病料样品进行RT-PCR鉴定,得到阳性率为73.3%(22/30)。进一步对此22株河南流行株的S基因进行了克隆及序列分析,其中,核苷酸和氨基酸序列比对结果显示,与经典毒株CV777相比,同源性分别为93.5%~94.0%、92.7%~93.5%。同时,22株流行株在S1区域第59~62位插入4个氨基酸(QGVN),在140位插入N,在第160位有一个G氨基酸的缺失,表明目前中国PEDV流行株已经发生了变异,且比对2010年以来的PEDV新毒株的S基因,其变异情况较为稳定。遗传进化分析结果显示,本研究毒株整体独立成支,与日本株、美国株亲缘较近,而与中国早年分离株、韩国早年分离株及经典CV777株亲缘关系较远。本研究从一定程度上解释了PEDV目前在猪群中普遍免疫失败的原因。前期研究表明,S蛋白基因的第636~789氨基酸的S1D区域能够诱导中和抗体的产生,且制备的免疫血清能够中和PEDV的S天然蛋白。为此,笔者克隆了PEDV CH-HNKF-15株S1D区域,通过pET-28a原核表达系统进行截短表达。用猪源PEDV全病毒血清作一抗,Western blot结果显示本研究成功表达出分子量约为16 kDa的目的蛋白。对重组表达菌的诱导条件进行优化,重组蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔,收取血清,Western blot结果显示融合蛋白和血清多抗可发生抗原抗体反应,表明本蛋白具有良好的生物活性。本研究为后续间接ELISA检测方法的建立、PEDV变异毒株S基因的功能研究及基因工程亚单位疫苗的研制提供了有力参考。猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)除了引发新生仔猪出现神经症状之外,还常常使妊娠母猪发生流产,产死胎或木乃伊胎,是当前制约中国养猪业发展的又一重要病原体。PRV基因组全长150 kb左右,含有多个与其复制无关的非必需基因,是常用的病毒活载体之一。因此,为了构建可以表达出PEDV S1D蛋白的重组PRV弱毒株,本试验用上游和下游引物均引入BamHI酶切位点的特异性引物扩增S1D,纯化回收,且将该目的基因插入到了PRV通用转移载体pG中gG启动子的下游,构建了重组伪狂犬转移质粒pGS1,并与PRV弱毒株基因组通过脂质体共转染ST细胞,经细胞内同源重组,获得了表达PEDV S1D基因的重组PRV弱毒株,命名为rPRV-pGS1株。结合绿色荧光观察、蚀斑纯化和PCR方法对重组病毒进行鉴定。经过5轮的蚀斑纯化,获得了纯化的重组PRV弱毒株rPRV-pGS1。经RT-PCR和Western免疫印迹检测表明PEDV S1D基因在重组病毒中获得了表达,表达出大小约为16 kDa的目的蛋白,并保持了其固有的生物学活性,结果表明本研究的重组病毒rPRV-pGS1株构建成功。本研究为PEDV和PRV联合防治提供了有效的理论和技术支持。