毛细管电泳新检测技术及其在法医毒物分析中的应用研究专业：法医学博士生：潘爱华导师：伍新尧教授随着全球化学品、药品、新型毒品的不断涌现，毒(药)物分析的对象在不断增加，分析技术也面临新的挑战。不断地探索和研究毒(药)物快速分离和高灵敏检测的新分析技术，是法医毒物分析的主要任务。 近十多年来，毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis，CE)以其分析速度快、分离效率高、样品和试剂消耗少等显著特点，发展极为迅速，成为分析领域极其重要的分离和检测技术之一。而新检测器的研究和应用，是CE发展的核心问题之一。微流控芯片毛细管电泳(Microfluidic-chipbasedcapillaryelectrophoresis，MCE)是近年发展起来的基于微机电加工技术(Microelectromechanicalsystems，MEMS)和CE原理的一种超高速、高效、高灵敏分析技术，是当前微全分析系统(Miniaturizedtotalchemicalanalysissystems，μ-TAS)最活跃的领域和发展前沿。由于激光诱导荧光(Laser-inducedfluorescence，LIF)检测是目前最灵敏的检测方法之一，因此它是当前微流控分析中最受关注的一种检测方式。 结合前沿分析技术的优势和毒物分析检测的需要，本论文拟研究基于毛细管电泳和微流控毛细管电泳检测的新技术，建立常见药毒物的快速、灵敏、高效、经济的分析方法，促进毒物分析检测技术的发展。论文内容分为以下六个部分：1.采用毛细管电泳高频电导检测器(HighFrequencyConductivityDetector,HFCD)，建立了尿液中MDMA(3，4-(methylenedioxy)-methamphetamine)及其主要代谢物MDA(3，4-(methylenedioxy)-amphetamine)的毛细管电泳快速分析方法。该法运用固相萃取技术制备样品，在优化条件下，9min内实现了MDMA和MDA的分离和检测。在2.5～80μg/mL线性范围内，检测限均达1.0μg/mL(S/N=3)，不同添加浓度尿样，日间和日内RSD均小于5％。本法快速、准确、灵敏，适于法医毒物分析和临床药物监测的需要。 2.采用反向电泳分离模式，建立了谷粒中杀鼠药氟乙酸钠的毛细管电泳高频电导检测方法。该法采用超声萃取处理样品，在优化条件下，氟乙酸钠在8.5min内获得了分离检测。在5.0～250μg/mL线性范围内，检出限为3μg/mL(S/N=3)，不同添加浓度谷粒样品的日间和日内RSD均小于5％。本法高效、快速、灵敏，适于法医和临床中毒急救中氟乙酸钠的快速分析。 3.采用反向电泳分离模式，建立了多种饮料中新型滥用药物γ-羟基丁酸(GHB)的毛细管电泳高频电导检测技术。饮料样品经稀释后直接进样，在优化条件下，6.5min内可实现GHB的快速分析。该法在10.0～150μg/mL线性范围内，检出限为3μg/mL(S/N=3)。不同添加浓度的饮料样本，日间和日内RSD均小于5％，回收率均在95％以上，适于体外检材中GHB的快速筛选分析。 4.自行设计和研制了一种正交型非共聚焦激光诱导荧光检测—微流控芯片毛细管电泳分析系统(Microfluidic-chipbasedcapillaryelectrophoreticsystemwithnon-confocallaser-inducedfuorescencedetectionbasedonorthogonalconfiguration，MCE-LIF)，数十秒内，可很好地分离模型物质荧光素和罗丹明B。在优化检测系统的基础上，采用玻璃芯片和动态涂层技术改性的PDMS/玻璃复合型芯片为分离载体，通过对模型物质的分离和检测，对微流控芯片系统的分析性能进行了评估，并对两种芯片的特性进行了表征，为芯片在微流控分析中的应用提供了理论依据和研究基础。研究结果表明，玻璃芯片的分析性能明显优于PDMS/玻璃复合型芯片；该系统采用有效长度为36mm的玻璃芯片、以10mmol/LNa284O7溶液为分离介质、2kV电压分离荧光素，检测限可低至0.1μmol/L，而塔板数为8711，塔板高仅为4.1μm，迁移时间RSD小于2％。 5.采用自组装微流控芯片系统，运用FITC(fluoresceinisothiocyanate)荧光衍生技术，建立了四种常见苯丙胺类化合物的芯片胶束电动毛细管色谱分析方法，并对该类化合物在芯片电泳中的分离效率和检测性能进行了研究。实验结果表明，在有效长度为34mm的玻璃芯片微通道中，采用470V/cm的场强，苯丙胺类衍生物在150s内得到了完全分离，而分离塔板数最大为23711，分离塔板高度最小仅为1.4μm，检测灵敏度达到了100ng/mL水平。该方法的建立为苯丙胺类化合物的超高速、高效分离和高灵敏检测提供了一种极具前景的分析技术。 6.运用荧光试剂DTAF(5-([4,6-Dichlorotriazin-2-yl]amino)fluorescein)，成功标记了鸦片类化合物吗啡。采用自行研制的微流控分析系统，对鸦片类化合物的荧光衍生产物进行了芯片毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测，根据分析结果的对比分析，对鸦片类化合物的DTAF荧光反应机理进行了推测与合理的解释。在有效长度为34mm的玻璃芯片微通道中，采用529V/cm的场强，鸦片类DTAF衍生混合物在60s内得到了超高速的完全分离，分离塔板数最高可达34439，最小塔板高度为1.0μm，吗啡—DTAF的检测限可低至0.5ppM，基本上可满足生物样本中吗啡检测灵敏度的需要，将来有望用于与实际样品中吗啡的检测。 结论：本文建立的毛细管电泳高频电导检测技术，具有快速、简便、经济、灵敏度高、精密度好等优点，为药毒物的检测提供了一种新的分离和分析方法，在法医药毒物分析中具有较好的应用前景。自行研制的基于微制造技术的微流控芯片毛细管电泳激光诱导荧光检测系统，具有体积小、结构简单、操作方便等优点。基于此技术平台所建立的药毒物的微芯片分离和激光诱导荧光检测方法，在超高速、高效分离、高灵敏检测中显示了卓越的优势。该技术平台的建立和完善，将促进药毒物分析仪器的微型化，并推动法庭化学实验室向“现场化”方向发展。