【摘 要】
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利用Pichia pastoris酵母整合型质粒pPICZaA-endo将人endostatin基因整合于Pichia pastoris酵母细胞染色体中,该质粒具有酿酒酵母a因子的信号肽、zeocin的抗性基因.实验过程
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利用Pichia pastoris酵母整合型质粒pPICZaA-endo将人endostatin基因整合于Pichia pastoris酵母细胞染色体中,该质粒具有酿酒酵母a因子的信号肽、zeocin的抗性基因.实验过程是将质粒线性化后,电转化Pichia pastoris甲醇酵母,质粒转入细胞后,质粒上AOX1基因的5启动子序列和3转录终止子序列能与宿主细胞染色体发生同源重组,在发生单交换时,使整个质粒插入到宿主染色体中.通过含zeocin抗性平板上的克隆、筛选、PCR鉴定和用甲醇诱导表达,筛选出一株能在Pichia pastoris中高效表达人endostatin基因的工程菌,经发酵检测,证实发酵后的工程菌产量为50mg/L.再经heparin柱亲和层析纯化,纯化的样品进行CAM方法活性检测,结果表明,所表达的rhEndostatin有很强的抑制鸡胚新生血管生成的能力.
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