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背景及目的:原发性干燥综合征（primary Sj（?）gren’s syndrome,p SS）是一种以淋巴细胞浸润外分泌腺造成的功能障碍为特征的慢性自身免疫性疾病。以口干、眼干为主要临床表现,以抗SSA抗体、抗SSB抗体及抗核抗体阳性为主要实验室检查特征,以灶性淋巴细胞浸润为病理特征。腺体内持续存在的淋巴细胞是损伤腺上皮细胞引起上皮细胞凋亡的重要原因。p SS的发病机制尚不明确,但认为mRNA和miRNA在疾病过程中起重要作用。目前已有大量研究证实在p SS患者中存在大量mRNA和miRNA差异表达谱,但是主要集中在病毒感染相关通路、IFN通路上。因此本研究通过RNA-seq方法,探索与淋巴细胞浸润相关的mRNA和miRNA,探索其作用机制,为在p SS患病过程中减少淋巴细胞浸润避免腺体破坏提供新的证据,为p SS提供新的诊治靶点。方法:1.mRNA测序和miRNA测序:a)研究纳入了2017年11月至2018年5月就诊于吉林大学第一医院风湿免疫科25例未经治疗的p SS患者,所有患者符合2016年ACR/EULAR修订的p SS分类标准。同时纳入性别年龄匹配且无p SS的25例健康人（healthy control,HC）作为对照组,对照组来自于吉林大学第一医院体检中心。b)5例p SS和5例HC作为测序组进行mRNA测序及miRNA测序,余20例p SS和20例HC作为验证组进行差异表达的RNA验证。收集上述人群的PBMC,进行RNA提取、mRNA测序、miRNA测序、RT-qPCR验证。2.hsa-miR-3202调控MMP2介导T细胞浸润:a)纳入另一组在吉林大学第一医院风湿免疫科就诊,伴有口干症状的未诊治的可疑p SS患者20人,所有人均进行唇腺活检检查。其中14人符合p SS的纳排标准（唇腺活检需符合灶性指数≥1个/4mm2）,作为p SS组;6人不符合p SS分类标准（需唇腺活检灶性指数（27）1个/4mm2）,作为Control组。b)取唇腺活检标本进行免疫组化染色,检测MMP2在组织中的表达情况。应用双荧光素酶实验验证hsa-miR-3202和MMP2之间靶向调控关系。c)Jurkat细胞转染hsa-miR-3202 mimics、mimics-NC、hsa-miR-3202 inhibitor、inhibitor-NC后应用RT-qPCR及Western Blot验证MMP2表达水平。d)Transwell检测转染预处理后的Jurkat细胞侵袭能力。3.hsa-miR-3202调控FAIM2介导细胞凋亡:a)Jurkat细胞转染hsa-miR-3202 mimics、mimics-NC、hsa-miR-3202 inhibitor、inhibitor-NC后检测细胞凋亡情况,ELISA检测IFN-γ和TNF-α分泌水平。b)通过Target Scan Human（www.targetscan.org）网站发现hsa-miR-3202的靶基因FAIM2。c)Jurkat细胞转染hsa-miR-3202 mimics、mimics-NC、hsa-miR-3202 inhibitor、inhibitor-NC后应用RT-qPCR及Western Blot验证FAIM2表达水平。d)在20例p SS和20例HC中验证FAIM2的表达及与临床指标相关性分析。e)敲低FAIM2后检测细胞凋亡情况及IFN-γ和TNF-α分泌水平变化。f)双荧光素酶实验验证hsa-miR-3202和FAIM2之间靶向关系。g)建立Transwell共培养体系,上室接种转染预处理的Jurkat细胞,下室接种HSG细胞,模拟浸润在唇腺组织中的T细胞及HSG细胞之间相互作用,应用凋亡实验检测HSG细胞（共培养后）凋亡情况,应用Ed U检测HSG细胞（共培养后）增殖情况。结果:（一）mRNA测序和miRNA测序:1.与HC组相比,p SS患者的PBMCs中有1671个mRNAs表达具有显著差异,其中1019个上调,652个下调。筛选出290个差异表达的miRNAs,其中143个上调,147个下调。2.上述差异表达基因中,共有84个mRNAs和49个miRNAs存在相互调控关系。84种mRNAs中,39种上调,45种下调。49个miRNAs中22个上调,27个下调。3.GO功能注释在分泌、参与免疫应答的髓细胞激活和髓细胞白细胞介导的免疫,α-N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶活化。4.KEGG通路富集在白细胞跨内皮迁移、补体系统。特别是白细胞跨内皮迁移途径与p SS中淋巴细胞浸润的病理特征相一致。其中MMP2和CLDN5均富集在白细胞跨内皮迁移途径。5.验证6种与免疫及唾液分泌相关的mRNA,p SS组MMP2、CLDN5和ANO2较HC组明显升高（P<0.05）,与测序结果一致。6.通过关联分析发现分别与MMP2、CLDN5具有调控作用的2个miRNA hsa-miR-3202（与MMP2具有调控作用）和hsa-miR-1291（与CLDN5具有调控作用）,p SS患者的hsa-miR-3202和hsa-miR-1291较HC组显著降低（P<0.05）,与测序结果一致。7.与临床指标相关性分析结果提示,CRP与MMP2相对表达量呈正相关（r=0.617,P=0.004）;ESSDAI评分与MMP2相对表达量呈正相关（r=0.710,P=0.001）。CLDN5相对表达量与ESSDAI评分呈正相关（r=0.644,P=0.002）。8.测序结果显示MMP2的log2FC为3.393和CLDN5的log2FC为2.1719,因此选择hsa-miR-3202与MMP2进行机制研究。（二）hsa-miR-3202调控MMP2介导T细胞浸润:1.免疫组化结果显示,与Control组相比,MMP2在唇腺组织中高表达,且在淋巴细胞浸润区域呈高表达。2.双荧光素酶实验结果提示hsa-miR-3202与MMP2无直接靶向关系,但是转染hsa-miR-3202 mimics后MMP2表达量明显降低;转染hsa-miR-3202 inhibitor后MMP2表达量明显升高。3.细胞侵袭实验结果显示,转染hsa-miR-3202 mimics组与mimics-NC组相比较,Jurkat细胞侵袭数占比减少,具有统计学意义（P=0.047）。转染hsa-miR-3202 inhibitor组较inhibitor-NC组Jurkat细胞侵袭数占比增加（P=0.032）。（三）hsa-miR-3202调控FAIM2介导细胞凋亡:1.过表达hsa-miR-3202使Jurkat细胞凋亡增加,IFN-γ和TNF-α分泌减少;低表达hsa-miR-3202使Jurkat细胞凋亡减少,IFN-γ和TNF-α分泌增多。2.过表达hsa-miR-3202可导致Jurkat细胞FAIM2表达降低,低表达hsa-miR-3202可使FAIM2表达升高;3.FAIM2在p SS组表达升高（P=0.002）,且FAIM2与CRP呈正相关（r=0.568,P=0.009）;4.敲低FAIM2与过表达hsa-miR-3202结果一致,可使Jurkat细胞凋亡增加,IFN-γ和TNF-α分泌减少;5.双荧光素酶实验结果提示hsa-miR-3202与FAIM2无直接靶向关系,二者存在间接调控作用;6.Transwell共培养结果提示,过表达hsa-miR-3202组和敲低FAIM2组的HSG细胞凋亡减少、增殖能力增加;低表达的hsa-miR-3202使HSG细胞凋亡增加,增殖能力减弱。结论:1.p SS患者PBMC中存在大量miRNA和mRNA的差异表达,尤其是MMP2及其具有调控作用的hsa-miR-3202,可能通过白细胞跨内皮迁移途径参与p SS的发病机制。2.hsa-miR-3202可以通过MMP2减弱p SS中淋巴细胞浸润唇腺的能力,起到保护性作用。3.hsa-miR-3202通过抑制FAIM2表达,促进T细胞的凋亡及抑制炎症因子分泌,进而减弱对HSG细胞损伤,抑制HSG细胞凋亡,保护HSG细胞。