【摘 要】
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目的:从结肠癌细胞株HT-29中分选出Tn+及Tn-细胞,分别检测AChE三种不同剪切体(AChE-T、AChE-H、AChE-R)表达状况与AChE启动子甲基化水平;探讨HT-29-Tn+及HT-29-Tn-结肠癌细胞
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目的:从结肠癌细胞株HT-29中分选出Tn+及Tn-细胞,分别检测AChE三种不同剪切体(AChE-T、AChE-H、AChE-R)表达状况与AChE启动子甲基化水平;探讨HT-29-Tn+及HT-29-Tn-结肠癌细胞中AChE表达调控机制,AChE、AChE抑制剂(新斯的明、石杉碱甲)、TNF-α对细胞增殖凋亡的影响,以及TNF-α与HT-29细胞表面Tn抗原的表达、AChE转录及蛋白表达水平之间的关系。方法:选用购自ATCC的人结肠癌HT-29细胞系,免疫磁珠分选获得纯化的HT-29-Tn-细胞和HT-29-Tn+细胞;于细胞培养板中培养,加入不同浓度(0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml)TNF-α,置于37℃细胞培养箱中培养48h。流式细胞术检测免疫磁珠分选前后以及TNF-α刺激培养后HT-29细胞表面Tn抗原表达的百分率。qRT-PCR,Western-blot分别检测AChE-T、AChE-H、AChE-R在基因转录与蛋白水平上的表达变化,ELISA检测分选前后细胞及其培养上清中AChE的分泌水平;CCK-8,Annexin V-FITC/PI检测TNF-α、AChE及AChE抑制剂(新斯的明、石杉碱甲)对HT-29-Tn-和HT-29-Tn+细胞增殖和凋亡的影响;BSP法检测HT-29-Tn-和HT-29-Tn+细胞AChE基因启动子区域的甲基化状态。结果:1.与HT-29-Tn-细胞相比,HT-29-Tn+细胞中AChE蛋白水平明显降低;AChE-T、AChE-H、AChE-R转录水平均下降;AChE基因启动子区域呈高甲基化。外源性的AChE抑制HT-29细胞增殖、诱导细胞凋亡;而AChE抑制剂(新斯的明、石杉碱甲)促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。2.TNF-α与HT-29细胞共培养过程中Tn+细胞明显增高;且在一定TNF-α浓度范围内Tn+细胞的百分率伴随TNF-α浓度增高而呈现上调趋势。TNF-α(0-30ng/ml)诱导HT-29-Tn-细胞凋亡具有剂量依赖相应,诱导HT-29-Tn+细胞凋亡的能力不明显;TNF-α浓度达到50ng/ml时,诱导HT-29-Tn-和Tn+细胞凋亡的作用明显增强,HT-29-Tn-细胞凋亡率更高。3.随TNF-α浓度增高HT-29细胞中AChE-T、AChE-H、AChE-R转录水平降低、AChE表达下降。结论:1.AChE启动子高甲基化导致HT-29-Tn+细胞AChE转录与蛋白水平下降。2.外源性AChE可诱导HT-29-Tn+和Tn-细胞凋亡。3.HT-29-Tn+和Tn-细胞对TNF-α的敏感性不同;TNF-α更易诱导HT-29-Tn-细胞凋亡。
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