埃博拉出血热(Ebola Hemorrhagic Fever,EHF)是由埃博拉病毒引起的能够感染人类及其他灵长类动物的高度接触性传染病,其主要症状为高热、出血,死亡率高达90%。埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)属于丝状病毒科丝状病毒属的成员,为单股、负链、有囊膜的RNA病毒。其表面的囊膜糖蛋白GP是高度糖基化的蛋白,在介导病毒侵入宿主细胞、诱导机体产生免疫反应等过程中起着关键性作用。分子伴侣钙连蛋白(CNX)、钙网蛋白(CRT)是存在于内质网中的一类分子,能够介导糖蛋白的加工和成熟过程。为了研究内质网分子伴侣CNX、CRT辅助埃博拉病毒囊膜糖蛋白成熟的机制,本试验首先利用CRISPR/Cas9技术构建了CNX、CRT基因敲除的293T细胞系。将表达埃博拉病毒囊膜蛋白GP mucin区域缺失基因(GP△MLD)的重组质粒,与囊膜蛋白缺失、表达荧光素酶(Luc)的人免疫缺陷病病毒I型(HIV-1)基因组的重组质粒共转染人胚胎肾细胞(293T),以包装整合含有埃博拉病毒囊膜蛋白的伪型EBOV病毒。在293T野生型(WT)、CNX KO、CRT KO、CNX/CRT D.KO的细胞中分别进行转染,结果显示在CNX KO、CRT KO的细胞系上GP△MLD蛋白的表达量和伪型病毒的包装效率与野生型细胞系相比有所降低,CNX/CRT D.KO细胞系上影响最为明显。免疫共沉淀实验显示CNX、CRT都会与Flag偶联的GP△MLD发生相互作用。该实验结果表明CNX、CRT在介导埃博拉病毒增殖过程中发挥关键性作用。为了进一步验证CNX、CRT影响GP△MLD蛋白成熟的作用机制,我们通过点突变的方法将GP△MLD的9个N-链接的糖链分别缺失后,发现N563、N618两点糖链的缺失使其在293T细胞中蛋白表达量有所下调,病毒组装能力及感染力明显降低。然后将糖链进行进一步N-端依次缺失或者进行组合缺失,结果显示,N563、N618两点糖链的同时缺失明显影响了伪型病毒的组装和感染效率。该结果提示N563、N618两点在维持GP△MLD的结构和功能方面发挥关键性作用。用Endo H酶消化处理蛋白裂解液,结果显示N563、N618两点糖链同时缺失的蛋白几乎全部被Endo H酶消化,由于糖链被剪切蛋白分子量变小,而野生型的蛋白则会有GP1蛋白进入高尔基体中从而不能被Endo H酶消化。结果表明N563、N618两点糖链的缺失通过将未成熟的蛋白以GP0的形式被阻滞在内质网中从而影响了蛋白的切割和进一步的加工过程,进而影响病毒蛋白的生物学功能。更为有意思的是,IP实验结果显示,C-端的5个糖链缺失后的GP△MLD与CNX、CRT的相互作用明显增强,而N-端4个糖链缺失后的GP△MLD与CNX、CRT的相互作用信号较弱。该结果提示C-端的糖链在维持GP△MLD蛋白结构和功能方面发挥重要作用,而CNX、CRT通过在内质网中阻滞错误折叠的GP蛋白的运输以此参与调节蛋白的质量控制系统。为了进一步验证上述结论在含mucin区域的全长GP蛋白结构中的可行性,我们在全长GP蛋白中验证上述结论。结果显示在CNX KO、CRT KO上蛋白表达和病毒组装能力有所降低,CNX/CRT D.KO上降低最明显。同时,N563、N618两点糖链的缺失使GP蛋白的剪切效率明显降低,病毒组装能力和感染力减弱。综上所述,本课题主要对CNX、CRT在GP蛋白糖基化修饰过程中的作用进行相关研究,证明了分子伴侣CNX、CRT与埃博拉病毒囊膜糖蛋白GP存在相互作用,缺失会影响GP的表达与成熟。GP的N563、N618两点糖链在蛋白成熟和病毒形成感染性病毒粒子的过程中发挥关键作用,两点糖链的缺失抑制了GP在内质网的切割作用,而且CNX、CRT通过增强与错误折叠的GP之间的相互作用阻滞其运输,诱导错误折叠的蛋白降解,维持细胞内的稳态。