论文部分内容阅读
近年来,氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）作为纳米载体用于药物递送已成为研究热点。GO具有独特的理化性质,如较大的比表面积、较低的生物毒性、较好的亲水性等,可以通过其特有的芳香共轭结构负载药物。但是,未经修饰的GO在生理溶液（如PBS缓冲液和细胞培养基）中容易发生团聚,影响其载药性能。因此,选择合适的材料和方法对GO进行修饰以改善其性质成为目前研究的重点。本课题设计了一种新型抗癌药物纳米载体的制备方法,首次采用生物材料壳寡糖（Chitosan oligosaccharide,CO）和γ-聚谷氨酸（γ-Polyglutamic acid,γ-PGA）共价修饰GO,负载抗癌药物盐酸阿霉素（Doxorubicin,DOX）,获得氧化石墨烯基复合材料纳米给药系统（GO-CO-γ-PGA-DOX）,并研究其细胞毒性及抗肿瘤机理。在此基础上,为了进一步提高该系统的靶向性,利用靶向核仁素（Nucleolin,又称C23）的核酸适配体NH2-AS1411（Aptamer NH2-AS1411,APT）修饰GO-CO-γ-PGA,获得靶向纳米给药系统APT-GO-CO-γ-PGA-DOX,并研究了其在抗肿瘤方面的作用。（1）首先利用一种简单经济的方法活化GO,使其通过酰胺键与CO结合,之后将预处理的γ-PGA与GO-CO上的CO通过酰胺键相连,完成GO-CO-γ-PGA的制备。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）、紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）、原子力显微镜（AFM）、透射电镜（TEM）以及Zeta电位测定等表征方法对其结构、组成成分、形貌以及分散性等进行分析,结果表明GO-CO-γ-PGA成功连接,呈现直径为200-300nm,厚度为7-8 nm的片层状结构,并在生理环境中表现出良好的分散性。（2）研究GO-CO-γ-PGA对DOX的负载和体外释放行为,实验结果表明GO-CO-γ-PGA的最大载药量为1.1883 mg/mg,GO-CO-γ-PGA-DOX可以在酸性条件（pH 5.0）下控释缓释DOX,累计释放率为52.58%,表现出pH响应性释放行为。细胞实验结果表明GO-CO-γ-PGA具有较好的生物安全性,可以负载DOX进入Hela细胞,通过感知肿瘤微环境的pH释放药物进入细胞核,发挥优异的抗肿瘤效果,其IC50值为3.50±0.01μg/m L。细胞实验和Western Blot实验结果证明,GO-CO-γ-PGA-DOX将Hela细胞抑制在G2/M期,上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达。二者异常表达导致线粒体去极化,促进细胞色素C（Cytochrome C,Cytc）释放。细胞质中的Cytc和凋亡蛋白酶激活因子-1（Apoptosis protease-activating factor-1,Apaf-1）相结合,再招募Procaspase-9形成凋亡小体,进而激活Caspase-9。Caspase-9进一步激活Caspase-3,切割多聚ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose polymerase,PARP）,从而使细胞凋亡。GO-CO-γ-PGA-DOX诱导Hela细胞凋亡依赖内源线粒体凋亡途径和Caspase的激活。（3）为了使该纳米载体具有靶向性,增强药物的抗肿瘤作用,利用NH2-AS1411功能化修饰GO-CO-γ-PGA,并分析其结构、组成成分及分散性等。通过对其载药能力的研究,表明APT-GO-CO-γ-PGA的最大载药量为1.2135 mg/mg,且高于GO-CO-γ-PGA,并且表现出对药物控释缓释的能力。细胞实验结果表明,因为C23在Hela细胞表面过量表达而在Beas-2B细胞表面不表达,所以APT-GO-CO-γ-PGA-DOX可以靶向结合Hela细胞,使其对Hela细胞的毒性高于Beas-2B细胞,APT-GO-CO-γ-PGA-DOX对Hela细胞的IC50值为3.23±0.04μg/m L。实验结果证明APT-GO-CO-γ-PGA可以靶向运输抗癌药物,达到增效减毒的效果,在生物医药领域具有广泛的应用前景。