论文部分内容阅读
利用植物净化空气中的甲醛污染时甲醛主要通过气孔进入植物体内,有研究表明环境中极低浓度甲醛胁迫就能导致植物气孔传导率显著下降,因此气孔的传导率是植物净化甲醛效率的重要制约因子。气孔开关机制一直是植物生理学研究的重点课题,有研究表明,蛋白磷酸酶1(PPl)在蚕豆保卫细胞蓝光信号途径中,在向光素下游和质膜H+-ATPase上游之间起正调控作用,催化质膜H+-ATPase的磷酸化反应,促进气孔开放。PP1由调节亚基和催化亚基(PPlc)组成,已经从蚕豆中克隆了四种编码PP1c蛋白的基因,分别为VfPp1c-1、VfPP1c-2、VfPP1c-3和VfPP1c-4,其中VFPP1c-1、 VfPP1c-3和VfPP1c-4主要在保卫细胞中表达。反义表达VfPP1c-1的蚕豆保卫细胞蓝光信号转导途径被显著抑制,因此VfPP1c-1基因编码的PP1c在蓝光诱导的气孔开放中起重要作用。本论文的前期研究表明在气体甲醛胁迫下,VfPP1c-1基因的转录水平被显著抑制。为了进一步了解VfPPlc-1在植物应答气体甲醛胁迫中的作用机理,以蚕豆和转基因烟草为实验材料,从生理和分子水平考察PPlc在植物应答气体甲醛胁迫的作用机制。主要得到以下结果：1.用0、5、10、20和40ppm气体甲醛处理盆栽蚕豆植株1h后,蚕豆叶片的VfPP1c-1基因的表达受到明显抑制。用家具柜中释放的环境污染气体甲醛对盆栽蚕豆植株进行低浓度气体甲醛胁迫24-72h,结果表明随着处理时间的延长,VfPP1c-1基因的表达逐渐被抑制,处理48h和72h后,柜内蚕豆叶片VfPP1c-1基因的表达明显低于柜外。这说明高浓度和低浓度气体甲醛胁迫均抑制蚕豆VfPP1c-1基因的表达,VfPP1c-1基因的表达参与蚕豆对气体甲醛胁迫的应答。2.PA(磷脂酸)抑制PP1c活性,正丁醇(1-BuOH)通过抑制磷脂酶D水解磷脂产生PA而促进质膜H+-ATPase磷酸化而增加质膜H+-ATPase的活性；NO是ABA(脱落酸)诱导气孔关闭信号转导途径中的重要成员,NO能促进PA的生成,硝普钠(SNP)是NO的供体,因此外源施加NO能够抑制PP1c活性。Tau(互变霉素)是PPlc的专一性抑制剂。用PPlc蛋白的激活剂和抑制剂处理盆栽蚕豆叶片下表皮,考察PPlc蛋白活性的改变是否影响气体甲醛胁迫下蚕豆叶片气孔传导率和气孔开度。研究结果表明在20 ppm气体甲醛胁迫下,外源施加1-BuOH处理3h能够缓解甲醛胁迫对蚕豆叶片气孔传导率和气孔开度的抑制作用,而外源施加300μM SNP处理3h和10μM Tau处理5h加剧甲醛胁迫对蚕豆叶片气孔传导率和气孔开度的抑制。对蚕豆叶片质膜H+-ATPase和H+泵活性测定的结果显示,甲醛胁迫下1-BuOH增强蚕豆叶片质膜H+-ATPase和H+泵活性,而SNP和Tau抑制质膜H+-ATPase活性和H+泵活性；免疫共沉淀分析结果显示甲醛胁迫下1-BuOH能够增强蚕豆叶片质膜H+-ATPase磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合,从而激活质膜H+-ATPase,而SNP和Tau的作用与1-BuOH相反。这些结果证实气体甲醛胁迫下抑制PP1c的表达,导致质膜H+-ATPase磷酸化水平下降,从而影响它与14-3-3蛋白的结合,降低质膜H+-ATPase的活性和H+泵活性,从而减小叶片气孔的传导率和开度。3.烟草是植物学领域研究用的重要模式植物,本论文利用VfPP1c-1基因表达改变的转基因烟草来考察VfPP1c-1基因在植物应答气体甲醛胁迫中的作用。结果表明在烟草中过量表达VfPP1c-1基因产生大量的PPlc蛋白,在20 ppm气体甲醛胁迫下增强了质膜H+-ATPase的磷酸化以及其与14-3-3蛋白的结合,增加质膜H+-ATPase的活性和H+泵活性,进而提高转基因烟草的气孔传导率和开度,最终增强转基因烟草对气体甲醛的吸收能力。此外,利用RNAi干扰技术获得NPP1基因抑制表达的转基因烟草,分析抑制表达NPPl基因对烟草响应气体甲醛胁迫的影响,结果表明抑制表达NPP1基因表达的同时也抑制了其他同源基因的表达,抑制NPP1表达转基因烟草在20 ppm气体甲醛胁迫下质膜H+-ATPase的磷酸化及其与14-3-3蛋白的结合受到的抑制作用加剧,转基因烟草质膜H+-ATPase活性和H+泵活性降低,导致气孔传导率和开度下降,最终导致转基因烟草甲醛吸收能力显著减弱。这些研究结果验证了VJPP1c-1基因在植物应答气体甲醛胁迫中的作用,为利用基因工程操作提高植物吸收气体甲醛能力提供新的操作策略和基因资源。