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沙门氏菌(Salmonella)是一种重要的食源性人畜共患病原体,给食品安全带来了严重的影响。随着抗生素的广泛使用,沙门氏菌对抗生素的耐药性逐渐增强。多粘菌素B作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线,目前已在人和动物的临床治疗中被广泛使用。近年来,随着多粘菌素B的使用量增加,沙门氏菌等多种革兰氏阴性细菌对多粘菌素B的耐药性逐渐增强,极大地降低了多粘菌素B使用的有效性,给人和动物的健康带来巨大的威胁。因此,本研究以161株沙门氏菌为研究对象,研究了多粘菌素耐药性、血清分型、mcr基因携带率,探讨了多粘菌素耐药特征。采用全基因组测序分析单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点、ept C基因表达载体构建和表达、多粘菌素B体外诱导和比较基因组学分析等技术,解析多粘菌素B的耐药机制。具体实验结果如下:1.通过微量肉汤稀释法测定160株江西省南昌市食源性沙门氏菌对多粘菌素B的耐药性,其中92株分离自2018年,68株分离自2020-2021年。2018年分离株的耐药率为5.4%,2020-2021年分离株的耐药率为14.7%,多粘菌素耐药性呈逐年递增趋势。采用沙门氏菌30种诊断血清试剂盒发现,160株食源性沙门氏菌主要鉴定出24种不同的血清型,另有51株沙门氏菌无法分型,其中2018年分离株主要流行的血清型是里森沙门氏菌(S.Rissen)、斯坦利维尔沙门氏菌(S.Stanleyville)、埃森沙门氏菌(S.Essen)和韦太夫雷登沙门氏菌(S.Weltevreden),2020-2021年分离株主要的流行血清型是鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、韦太夫雷登沙门氏菌和肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)。探究血清型与耐药性的关系发现,鼠伤寒沙门氏菌对多粘菌素B的耐药率(20.0%)普遍较高。2.对15株多粘菌素B耐药的食源性沙门氏菌进行mcr-1至mcr-9耐药基因的PCR筛查发现,仅检测到1株婴儿沙门氏菌(2018年分离)携带mcr-1基因,其他样本均未检出mcr基因。选取4株mcr阴性但耐多粘菌素B的食源性沙门氏菌进行全基因组测序,筛查多粘菌素耐药相关的双组分系统基因SNP突变,发现4株菌共有的SNP突变主要集中在ept C和mic A基因。PCR扩增耐多粘菌素B菌株A7的ept C基因全长,构建pkk223-ept C表达载体并转入DH5α、多粘菌素B敏感菌NC28和多粘菌素低耐药菌株NC141中,测定重组菌多粘菌素的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)值,MIC均与出发株相比没有变化。3.双相亚利桑那是一种少见的血清型,其多粘菌素耐药机制未见相关报道。用多粘菌素B体外诱导双相亚利桑那沙门氏菌临床株S499,诱导15次后挑选5株突变菌株,发现突变菌株均对多粘菌素B表现出较高水平的耐药。其中,突变株PB2、PB3、PB4的MIC值是S499野生型菌株的267倍。PB1和PB5的MIC值是S499野生型菌株的133倍。进一步通过PI单染和PI/CFDA双染后进行流氏细胞仪检测发现,多粘菌素B可以破坏S499野生株细胞膜的完整性,但对突变株的破坏能力明显减弱。4.选取多粘菌素诱导突变株PB5进行全基因组测序,与野生株相比,PB5突变株染色体上出现大片段三次重复插入,该片段包含IS1家族蛋白Ins B介导的NADH泛醌氧化还原酶、转导蛋白相关基因pmr D、操纵子arn BCADTEF、编码合成庚糖磷酸酶基因pmr G等多粘菌素B耐药相关基因。进一步分析发现,在PB5突变菌株序列中缺少一部分鞭毛组装蛋白Flg J、Flg I、Flg K等需要重复复制的序列。综上所述,本论文研究了江西省南昌市食源性沙门氏菌多粘菌素耐药状况,发现多粘菌素耐药有递增趋势,多粘菌素耐药主要由染色体上双组分系统SNP突变介导,多粘菌素耐药株在ept C和mic A基因上存在一些共有的SNP突变,ept C的SNP突变不能导致多粘菌素耐药。体外诱导实验揭示,双相亚利桑那沙门氏菌多粘菌素耐药也与双组分系统pho PQ/pmr AB的基因重复插入和高表达有关。本文为多粘菌素耐药机制和耐药趋势跟踪监测提供了新的数据参考和支持。