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细胞核转化存在转基因沉默和转基因逃逸等不可避免的问题。高等植物叶绿体转化因具有外源基因可按设计位点整合、叶绿体基因组单亲母性遗传、高拷贝表达目的蛋白等优点,被作为细胞核转化的互补技术。目前,扩大叶绿体转化的受体植物种类及非抗生素选择标记的应用是其发展的新趋向和研究的重点之一。本研究以牧草菊苣为材料,建立其叶片离体再生体系及叶绿体转化体系,不仅扩大叶绿体遗传转化的受体植物种类,而且为将来通过叶绿体转化对菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。实验取得以下成果：1.优化了普那菊苣叶片离体再生体系,研究了不同激素浓度配比对菊苣叶片不定芽发生及生根的影响。结果显示：菊苣叶片不定芽直接发生的最佳培养基为MSo+6-BA1.5mg/L+NAA0.4mg/L,最佳生根培养基为1/2MS0+NAA0.2mg/L2.探讨了烟草、菊苣对壮观霉素和甘露糖的敏感性。当壮观霉素浓度分别为500mg/L和100mg/L时,对应烟草和菊苣的叶片外植体生长完全被抑制；当甘露糖+蔗糖浓度分别为30g/L+0g/L和29g/L+1g/L时,对应烟草和菊苣的叶片外植体生长完全被抑制,由此确定壮观霉素500mg/L或甘露糖30g/L为烟草叶绿体转化的选择压力,壮观霉素100mg/L或甘露糖29mg/L为菊苣叶绿体转化的选择压力。3.通过PCR的方法扩增了0.72kb的GFP基因和1.2kb的6-磷酸甘露糖异构酶基因PMI,利用实验室保存的嵌合有菊苣叶绿体同源片段rpsl2和trnv-16SrDNA序列的载体pJLR1,以及包含菊苣叶绿体基因调控序列和筛选标记基因aadA的载体pARpt,通过常规的DNA体外重组技术,以GFP为报告基因,分别以抗生素标记基因aadA和安全标记基因PMI为筛选标记,构建了四个菊苣叶绿体定点整合表达载体,其中两个为操纵子表达盒载体pJAD-S/F和pJADM,两个为串联表达盒载体pJBC-S/F和pJBCM。各载体经多重酶切检测和测序验证,符合预期设计4.进行了pJAD-S和pJBC-S对烟草和菊苣叶绿体的基因枪转化,建立了相应的叶绿体遗传转化体系,获得了烟草、菊苣壮观霉素抗性苗。以菊苣基因组总DNA为模板,PCR分别扩增出了GFP、aadA-GFP嵌合序列以及GFP-trnv-16SrDNA嵌合序列,表明外源基因全部整合进了叶绿体基因组；激光共聚焦显微镜下观察到叶绿体中有绿色荧光,证明外源基因在叶绿体中成功表达。