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犬流感是能够引起犬急性呼吸道症状的高度接触性传染病。作为伴侣动物,犬携带犬流感病毒对人和其他动物造成潜在的威胁。但是,犬流感病毒的感染机制仍然不明确,因此为了更好地预防和治疗犬流感,有必要对其感染机制进行更深入的研究。流感病毒可以诱导细胞发生病变,其中凋亡是一种表现。MicroRNA是一类可对基因表达水平进行转录后调节的短链RNA。Let-7作为犬肺和气管内表达丰度第二高的家族,其对细胞凋亡的调控起着重要作用。本文以H3N2亚型CIV为对象,观察其诱导产生的细胞凋亡现象,并研究了let-7a对CIV所引起的细胞凋亡的影响及其通过何种通路影响到细胞凋亡。本实验在体外用H3N2亚型CIV感染MDCK细胞,通过直接显微镜观察、AO/EB染色凋亡检测法、Annexin-V FITC/PI双染料凋亡检测法检测CIV能否引起细胞凋亡。结果发现,H3N2亚型CIV感染MDCK细胞后,显微镜下观察发现能够引起细胞固缩、变圆、聚集漂浮;AO/EB染色凋亡检测法测得感染后24 h和48 h,感染组凋亡率分别为(20.7±1.6)%和(22.3±2.2)%,显著高于对照组的细胞凋亡率(8.1±1.1)%和(8.9±1.7)%;Annexin-V FITC/PI双染料凋亡检测法测得感染后24 h和48 h,凋亡率分别达到(15.53±0.49)%和(15.87±0.58)%,显著高于对照组的(4.13±0.24)%和(7.2±0.38)%。表明CIV感染MDCK细胞后,能够引起细胞发生显著的凋亡。诱导细胞产生凋亡以后,收集细胞,通过抽提RNA、反转录、荧光定量PCR测得let-7a的表达水平。随后通过转染let-7a,测定过表达或抑制let-7a对于CIV所引起细胞凋亡的影响。荧光定量PCR测得凋亡发生后let-7a表达下调,随后的let-7a过表达实验表明let-7a能够抑制凋亡发生,let-7a抑制试验表明抑制let-7a表达后能够促进凋亡的发生。结果表明let-7a能够起到抑制凋亡作用,而其低表达间接促进了凋亡。在确定了let-7a能够对细胞凋亡产生影响之后,通过靶向预测软件预测let-7a的靶基因,并构建到双荧光素酶报告载体psi-check2上进行细胞验证。通过靶向预测软件预测出let-7a的靶基因MAP4K3后,构建到psi-check2双荧光素酶报告质粒上,通过细胞转染实验证明let-7a能够直接靶向于MAP4K3 3’UTR。随后,通过荧光定量PCR和Western Blot检测其通路下游凋亡相关蛋白的表达来确定凋亡是否通过线粒体途径来实现。凋亡通路相关蛋白的检测也证实let-7a对细胞凋亡的影响可以通过改变MAP4K3蛋白、bcl-2/bax蛋白、caspase家族蛋白的表达来实现。本实验用H3N2亚型犬流感病毒成功感染MDCK细胞,并诱导产生凋亡,为犬流感的基础研究提供支持。本试验还通过体外转染microRNA-let-7a,证实过表达let-7a能够有效地抑制细胞凋亡,而let-7a低表达则促进凋亡。本文还为犬流感病毒感染和let-7a关系提供了理论和数据支持。进一步研究发现let-7a对细胞凋亡的影响可以通过线粒体凋亡通路来实现。本文为let-7a对细胞凋亡影响的研究提供了数据支持。