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对虾是我国重要的水产养殖产品,具有重要的经济意义。但其养殖易受如白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)等病原的侵害,造成巨大的经济损失。对虾主要依靠先天免疫抵抗病原的侵害,因此对日本囊对虾先天免疫防御机制的研究具有重要意义。C型凝集素(C-type lectin, CTL)是甲壳动物中一种重要的模式识别受体。本研究选取日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)为实验动物,研究了两种含有低密度脂蛋白受体家族A结构域(LDLa, low-density lipoprotein receptor class A domain)的C型凝集素Ld1rLec1与Ld1rLec2在抗病毒免疫中的功能及可能的作用机制。LSm14A是RNA结合蛋白LSm(like-Sm)家族的一员,在抗病毒免疫中具有重要功能,本文还对日本囊对虾中新发现的三种MjLSm在抗病毒免疫中的功能进行了研究。1.日本囊对虾C型凝集素Ld1rLec1与Ld1rLec2的功能研究C型凝集素是一大类含有糖类识别结构域(CRD, carbohydrate recognition domain)的蛋白家族,在生物中分布广泛。甲壳动物中含有大量的C型凝集素,大都具有一个CRD结构域,多数甲壳动物C型凝集素表达于血细胞和肝胰腺中。有的C型凝集素丧失了凝集功能,但仍作为模式识别受体参与对病原的识别。有的凝集素具有促进血细胞对病原微生物吞噬的功能,还有一些C型凝集素具有杀菌的功能。C型凝集素在抗病毒先天免疫中也具有重要的功能。因此从分子水平上研究LdlrLec1与LdlrLec2在日本囊对虾先天免疫中的功能与作用机制,对于深入了解宿主对病原微生物的抵御、探索有效的免疫预防方式具有重要意义。LdlrLec1与LdlrLec2几乎在所有组织中均有表达,但是LdlrLec1主要在血细胞、心、鳃和肠内表达,而LdlrLec2主要在肝胰腺和心内表达。在受到WSSV刺激后,LdlrLec1与LdlrLec2的表达发生显著上调。LdlrLec1与LdlrLec2能够发生异源寡聚化。向日本囊对虾体内注射LdlrLec1与LdlrLec2重组蛋白能够抑制WSSV的复制,并降低了日本囊对虾感染WSSV后的累积死亡率。利用RNA干扰敲低LdlrLec1与LdlrLec2则会促进WSSV在对虾体内的复制,重新注射LdlrLec1与LdlrLec2蛋白能够抑制WSSV的复带。Pull down实验显示LdlrLec1与LdlrLec2蛋白能够与WSSV的囊膜蛋白VP28结合,并且主要依赖CRD结构域发挥功能。LdlrLec1和LdlrLec2蛋白与WSSV孵育后感染血细胞的效率与对照组相比发生显著下调。这些结果表明LdlrLec1与LdlrLec2通过CRD结构域结合WSSV的囊膜蛋白VP28,从而抑制WSSV在对虾体内的侵染和复制,在对虾的抗病毒免疫中发挥功能。2.日本囊对虾新型模式识别受体MjLSm抗病毒功能研究LSm蛋白是RNA结合蛋白,在多种生物中分布广泛,通常可以形成六聚体或者七聚体的复合物发挥功能,能够参与mRNA前体的加工、剪接以及mRNA的脱帽反应等。LSm14A,又称为RAP55(mRNA-associated protein55),被认为是一种新型的模式识别受体,位于细胞质处理小体(P-body)上。人类的LSm14A在病毒感染的早期,能够与病毒核酸结合,然后部分从P-body转位到过氧化物酶体,激活下游相关信号通路,最终诱导干扰素表达,在抗病毒先天免疫中发挥功能。但甲壳动物中的LSm14A尚未见报道,我们在日本囊对虾发现了3种LSm14A,分别命名为MjLSm1、MjLSm2与MjLSm3,对其功能进行了初步研究。MjLSm1、MjLSm2与MjLSm3在多种组织中分布广泛。MjLSm1、MjLSm2与MjLSm3在N端均含有一个Sm结构域,在C端均含有一个FFD结构域。其中MjLSml在血细胞、心、肝胰腺中表达较高,在鳃内表达相对较低；MjLSm2在血细胞和肝胰腺中表达较高,在心和肠内表达相对较低；MjLSm3在肝胰腺中表达较高,在血细胞和鳃内表达略低,在胃肠内基本无表达。在WSSV刺激后,MjLSm1、MjLSm2与MjLSm3表达均发生上调。MjLSm1、MjLSm2和MjLSm3蛋白还能够与WSSV dsRNA结合。干扰MjLSm促进WSSV在对虾体内的复制,并调控参与抗病毒免疫的甲壳肽crustin4与crustin11表达下调。过表达MjLSm1、 MjLSm2或MjLSm3均能够抑制WSSV在对虾体内的复制。分别过表达MjLSm1与MjLSm2后,对虾感染WSSV时crustin4表达上调,分别过表达MjLSm1、 MjLSm2或MjLSm3后,对虾感染WSSV时crustin11表达发生上调。这些结果表明MjLSm在日本囊对虾感染WSSV时参与调控crustin4与crustin11的表达,在抗病毒免疫中发挥功能。