【摘 要】
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目的1.观察在BCG感染的巨噬细胞中miRNA-6857-3p的表达情况。2.在BCG感染的巨噬细胞中验证miRNA-6857-3p与Sp110基因m RNA之间的靶向关系。3.在BCG感染的巨噬细胞中验证siRNA与Sp110基因之间的关系。4.探究miRNA-6857-3p在BCG感染巨噬细胞中与自噬反应发生之间的关系。5.观察雷帕霉素激活BCG感染的巨噬细胞中Akt/mTOR通路对miRNA
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目的1.观察在BCG感染的巨噬细胞中miRNA-6857-3p的表达情况。2.在BCG感染的巨噬细胞中验证miRNA-6857-3p与Sp110基因m RNA之间的靶向关系。3.在BCG感染的巨噬细胞中验证siRNA与Sp110基因之间的关系。4.探究miRNA-6857-3p在BCG感染巨噬细胞中与自噬反应发生之间的关系。5.观察雷帕霉素激活BCG感染的巨噬细胞中Akt/mTOR通路对miRNA-6857-3p的调节情况。6.观察过表达miRNA-6857-3p对巨噬细胞中Akt/mTOR通路的影响。7.检测miRNA-6857-3p的模拟物（mimic）及抑制剂（inhibitor）对BCG感染巨噬细胞增殖的影响。方法1.利用BCG按照不同感染时间以及不同的感染复数对巨噬细胞进行感染,实时荧光定量PCR检测miRNA-6857-3p在不同条件下的表达情况。2.利用Lipofectamin TM3000 Reagent分别包裹miRNA-6857-3p mimic及miRNA-6857-3p inhibitor并对BCG感染的细胞RAW264.7实现转染,利用western blot对表达Sp110蛋白情况进行检测。3.利用Lipofectamin TM3000 Reagent包裹siRNA对BCG感染的RAW264.7细胞进行转染,利用western blot方法检测Sp110蛋白的相对表达量。4.用Lipofectamin TM3000 Reagent分别包裹miRNA-6857-3p mimic及miRNA-6857-3p inhibitor并对BCG感染的RAW264.7细胞予以转染,运用western blot对LC3蛋白表达的情况进行检测。5.用Lipofectamin TM3000 Reagent分别包裹miRNA-6857-3p mimic及miRNA-6857-3p inhibitor并对BCG感染的RAW264.7细胞予以转染,运用western blot对Akt/mTOR通路相关蛋白进行检测。6.分别利用雷帕霉素及3-MA对BCG感染的RAW264.7细胞进行诱导,用实时荧光定量PCR检测miRNA-6857-3p的相对表达量。7.用CCK-8进行细胞增殖实验,通过酶标仪测量不同待测物质位于450 nm区域的OD值。了解miRNA-6857-3p inhibitor组与mimic组在BCG感染的巨噬细胞不同时间点的增殖情况,探究miRNA-6857-3p及其inhibitor对BCG感染巨噬细胞增殖之间的关系。结果1.BCG感染的巨噬细胞可以引起miRNA-6857-3p表达量的上升。2.BCG的感染的巨噬细胞中miRNA-6857-3p与Sp110基因具有靶向关系。miRNA-6857-3p mimics转染BCG感染的RAW264.7细胞株能够抑制Sp110的蛋白表达,而在miRNA inhibitor+BCG组我们则发现miRNA-6857-3p抑制剂可以使得SP110蛋白的表达量上升,使上述结果发生逆转。3.siRNA转染感染BCG之后的48小时之后细胞RAW264.7中,BCG+siRNA组对比BCG组Sp110蛋白显著的降低（P<0.01）。4.在BCG感染的巨噬细胞中,利用miRNA-6857-3p mimic过表达miRNA-6857-3p可以调节自噬相关蛋白表达情况,降低LC3Ⅱ/Ⅰ比值,而在miRNA-6857-3p inhibitor进行阻断后发现LC3Ⅱ/Ⅰ比值上升。5.在BCG感染的巨噬细胞中Akt/mTOR通路的激活可以抑制miRNA-6857-3p的表达水平。6.miRNA-6857-3p参与了Akt/mTOR通路的信号调节。7.CCK-8结果显示相较于BCG+mimic组,BCG+inhibitor组巨噬细胞的增殖活力减弱。结论1.miRNA-6857-3P与Sp110基因之间存在靶向关系。2.miRNA-6857-3p可以通过调节Sp110基因调节巨噬细胞自噬。3.miRNA-6857-3p通过调节Sp110基因部分调节Akt/mTOR信号通路实现对自噬的调节作用,从而对BCG增长、增殖情况产生影响。
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