论文部分内容阅读
目的:探究鼠巨细胞病毒（MCMV）感染所致miR-1929-3p差异表达在小鼠血管平滑肌细胞增殖重塑中的作用和机制。方法:（1）采用MCMV Smith株腹腔感染小鼠血管平滑肌细胞（MOVAS）,实验分为对照组（Control组）及MCMV感染组（MCMV组:感染复数MOI分别为0,0.001,0.01,0.1,1,感染时间为8h、12h、24h、48h）。采用PCR技术对MOVAS进行MCMV-DNA检测,从而建立MCMV感染小鼠的血管平滑肌细胞模型。（2）将20nM的miR-1929-3p模拟剂（miR-1929-3pmimic）和30nM的抑制剂（miR-1929-3p inhibitor）转染 24h,再次将小鼠分为六组:Control 组、MCMV 组、MCMV-+ mimic-NC组、MCMV+miR-1929-3p mimic 组、MCMV+inhibitor-NC 组和 MCMV+miR-1929-3p inhibitor 组,建立miR-1929-3p干预模型。（3）采用实时定量PCR（qRT-PCR）方法验证差异表达miR-1929-3p及靶基因内皮素A型受体（ETAR）mRNA相对表达量水平。（4）通过转染ETAR过表达腺病毒载体,转染时间为48h和MOI为1000,再次分为六组:Control组、MCMV组、MCMV+mimic-NC组、MCMV+mimic 组、MCMV+ mimic+Ad-NC 组和 MCMV+ mimic+Ad-ETAR 组。（5）加入 10nM ETAR抑制剂（BQ123）或100nM的NLRP3炎症小体抑制剂（MCC950）后,进行分组:Control组、MCMV组、MCMV+BQ123 组、MCMV+inhibitor-NC、MCMV+ inhibitor 组和 MCMV+ inhibitor+MCC950组。（6）EdU检测用来检测miR-1929-3p对小鼠血管平滑肌细胞增殖的影响;细胞流式检测对细胞凋亡的影响。（7）ELISA检测小鼠血管平滑肌细胞培养基上清液中IL-18、IL-1β的浓度。（8）运用蛋白免疫印迹法（Western blot）测定miR-1929-3p对血管增殖重塑蛋白（a-SMA、PCNA、OPN）及NLRP3炎症小体激活的相关蛋白（NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18）及ETAR的表达影响。（9）实验数据进行统计学处理,统计方式采用SPSS 20.0统计学软件。结果:（1）模型建立:将小鼠血管平滑肌细胞用MCMV感染,检测到MCMV DNA表达,说明MCMV感染模型成功建立。（2）MCMV不同感染复数和感染时间CCK8检测细胞增殖率:结果显示:在MOI=0.01、48h时小鼠血管平滑肌细胞增殖最明显。（3）MCMV 对miR-1929-3p和靶基因ETAR的调控:qRT-PCR结果显示:与Control组相比,MCMV组的miR-1929-3p的表达下降（P<0.05）;ETAR mRNA 表达明显升高（P<0.05）;MCMV+mimic 组与 MCMV+mimic NC 组相比,miR-1929-3p 表达量明显升高（P<0.001）,ETAR 的 mRNA 表达下降（P<0.05）;MCMV+inhibitor 组的 miR-1929-3p的表达与MCMV+inhibitor NC组相比无明显差异（P>0.05）,而ETAR mRNA水平明显升高（P<0.05）。Western blot 结果显示:MCMV组与 Control组相比,ETAR蛋白表达增多（P<0.05）;MCMV+mimic 组与 MCMV+ mimic NC 组相比,ETAR 明显减少（P<0.05）;与 MCMV+ inhibitor NC 组相比,MCMV+inhibitor组的ETAR表达增高（P<0.05）。（4）MCMV诱导miR-1929-3下调对细胞增殖重塑作用:免疫荧光和Western blot结果显示,与Control组相比,MCMV组的EdU的阳性率、OPN和PCNA的蛋白表达明显增多（P<0.05）,α-SMA蛋白表达降低（P<0.05）;与MCMV+mimic NC组相比,MCMV+miR-1929-3p mimic组的EdU的阳性率和OPN和PCNA的蛋白减少（P<0.05）,α-SMA 蛋白增多（P<0.05）;与 MCMV+inhibitor NC 组相比,MCMV+miR-1929-3p inhibitor 组的EdU的阳性率和OPN和PCNA蛋白含量升高（P<0.05）,α-SMA蛋白含量下降（P<0.05）。（5）MCMV感染诱导miR-1929-3下调对细胞凋亡作用:流式细胞检测和Western blot结果显示,MCMV组与Control组相比,细胞凋亡率和Bax表达增多（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达减少（P<0.05）;与MCMV+mimic NC 组相比,MCMV+miR-1929-3p mimic 组的凋亡率和 Bax 表达减少（P<0.05）,Bcl-2 的表达增多（P<0.05）;与 MCMV+inhibitor NC 组相比,MCMV+miR-1929-3p inhibitor 组的凋亡率和Bax 含量增多（P<0.05）,Bcl-2 蛋白含量减少（P<0.05）。（6）ETAR 在 MCMV 诱导 miR-1929-3 下调影响细胞增殖重塑中的作用:EdU和Western blot结果显示,与Control组相比,MCMV组的增殖率升高（P<0.05）,OPN和PCNA的蛋白表达升高,α-SMA蛋白表达下降（P<0.05）;与MCMV+mimic NC 组相比,MCMV+miR-1929-3p mimic 组的增殖率明显降低（P<0.05）,OPN 和 PCNA 的蛋白表达下降,α-SMA蛋白表达升高（P<0.05）;MCMV+miR-1929-3p mimic+Ad-ETAR组的增殖率、OPN和PCNA蛋白表达明显增多（P<0.05）,α-SMA表达降低（P<0.05）。（7）ETAR在MCMV诱导miR-1929-3下调影响细胞凋亡中的作用:细胞流式和Western blot结果显示:与Control组相比,MCMV组的凋亡率升高（P<0.05）,Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降（P<0.05）;与 MCMV+miR-1929-3p mimic+Ad-NC 组相比,MCMV+ miR-1929-3p mimic+ Ad-ETAR 组的凋亡率升高（P<0.05）,Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降（P<0.05）。（8）MCMV诱导miR-1929-3下调对NLRP3炎症小体相关蛋白表达影响:Western blot结果显示,与MCMV组相比,MCMV+BQ123组抑制了 NLRP3、Caspase1、IL-1β的表达下降（P<0.05）,IL-18表达无明显差异（P>0.05）;与MCMV+miR-1929-3p inhibitor NC 组相比,MCMV+miR-1929-3p inhibitor 组的 NLRP3、Caspase1、IL-1β 的表达升高（P<0.05）,IL-18 表达无明显差异（P>0.05）;与 MCMV+miR-1929-3p inhibitor组相比,MCMV+miR-1929-3p inhibitor+MCC950 组的 NLRP3、Caspase1、IL-1β 的表达明显被抑制（P<0.05）,IL-18 表达无明显差异（P>0.05）。结论:MCMV感染促进了小鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡,其机制可能是通过下调miR-1929-3p的表达,促进靶基因ETAR的上调和NLRP3炎症小体激活实现的。