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过氧化物还原因子(暂定名)(Peroxiredoxin,Prx)是植物体内活性氧清除系统中很重要的一员,可以和很多发生过氧化底物发生反应而清除细胞内积累的活性氧。所有的Prx都含有至少一个保守的半胱氨酸残基,在清除活性氧的反应中,Prx中Cys残基的-SH被顺次氧化成次磺酸(sulfenicacid)、亚磺酸(sulfinicacid)和磺酸(sulfonicacid)三种形式,过氧化的-SH与其他含有自由巯基的蛋白形成亚硫酰物。发生了过氧化的Prx不再具备原来的酶活性,但硫过氧化物还原因子(暂定名)(Sulfiredoxin,Srx)可以将发生了过氧化而失活的Prx还原回活性形式。目前研究的较多的是哺乳动物和酵母的Srx,而植物Srx的生理生化功能尚未见到报道。
我们通过研究正常和胁迫条件下的基因表达模式分析、酵母功能互补、病毒诱导基因沉默(VIGS)系统、T-DNA插入突变体及过量表达转基因材料表型分析、体外化学组织染色、叶绿素荧光及叶绿素含量测定、体外活性氧活性测定等方法初步探究了拟南芥Prx和Srx的生理生化特性。
RT-PCR结果表明,不同胁迫条件下不同AtPrx成员具有不同的响应模式。其中AtPrxⅡC几乎对所有的处理都有相应,尤其在衰老后期,当其他Prx的表达量都在锐减时,AtPrxⅡC却大量诱导表达。这暗示AtPrxⅡC在衰老过程中可能起着很重要的作用。另外AtPrxⅡC对羟自由基似乎不起作用,而可能会专一的对过氧化氢有响应。利用体外表达、纯化的蛋白做的体外H2O2活性测定结果也表明,AtPrxⅡC清除H2O2的能力比2C-AtPrxB、AtPrxⅡF和1C-AtPrx都要高。为了进一步研究AtPrxⅡC的生理功能,我们利用VIGS系统在烟草中过量表达了AtPrxⅡC。实验结果表明,不论是在由于烟草PDS减量表达造成的体内氧化胁迫条件下,还是在由于paraquat处理引起的体外氧化胁迫条件下,过量表达AtPrxⅡC后都会有效减轻氧化胁迫造成的光漂白。叶绿素荧光合叶绿素含量测定结果表明,过量表达AtPrxⅡC会在氧化胁迫下保护叶绿素的过度减少以及避免光合机构的破坏。由于AtPrⅡC定位在胞质,所以这种保护功能很可能是一种间接作用。
氨基酸序列比对结果表明,真核生物Srx的一级结构非常保守,所有的Srx氨基酸序列中都含有Gly-Cys-His-Arg(GCHR)模块。AtSrx、OsSrx和LeSrx能互补Srx1酵母突变体(MATalpha;his3△1;leu2△0;lys2△0;ura3△0;YKL086w∷kanMX4),使之能在含有2.0mMH2O2和/或4.0mMDiamide的平板上生长。
AtSrx和2C-AtPrx都定位在叶绿体,并且在H2O2和Diamide等氧化剂处理下AtSrx表达变化和由同样胁迫条件引起的AtPrx表达变化是一致的,二者在亚细胞定位和胁迫条件下表达变化的一致性暗示了二者体内互作的可能性,酵母双杂和BiFC结果也表明,拟南芥的Srx能特异地和2C-PrxA、2C-PrxA发生互作。根据AtSrx和2C-AtPrx亚细胞定位、胁迫下表达模式以及蛋白互作的结果可以推测,在过氧化胁迫条件下,AtSrx可通过还原失活的2C-Prx来保护叶绿体使之免受活性氧损害。
我们利用T-DNA插入突变体和AtSrx过量表达转基因材料研究了AtSrx在植物体内的生理功能。paraquat处理、Diamide处理以及过量铁离子处理后,转基因材料的表型分析和叶绿素荧光、叶绿素含量等生理指标变化测定结果表明:T-DNA插入突变植株叶绿体中的活性氧不能得到及时有效的清除,致使光系统受到了活性氧的直接破坏,而过量表达AtSrx后,则可使AtPrx的功能得到及时恢复,从而使叶绿素得到有效保护。H2O2处理后,随H2O2浓度的增加,转基因植株并未出现失绿现象,但生育周期有逐渐缩短的迹象。这暗示在这个浓度范围内,外源的H2O2不会直接对叶绿素造成伤害,可能会影响到H2O2的信号传导过程,但这一点有待进一步的研究证实。
上述有关AtPrx和AtSrx生理和生化功能的研究为以后其在生产中的应用(尤其是在抗逆生理中的应用)打下了理论基础。