论文部分内容阅读
背景:急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是一种临床常见疾病,最终可能发展为慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）或终末期肾病（End stage renal disease,ESRD）。脓毒症是重症病房（Intensive care unit,ICU）患者发生AKI的主要原因。脓毒症诱导急性肾损伤（Sepsis induced acute kidney injury,S-AKI）主要表现为过度炎症反应、微循环障碍和线粒体功能障碍。目前尚无有效的药物能够预防或治疗脓毒症诱导急性肾损伤。研究发现肠道和肾脏之间存在着密切联系,并提出“肠-肾”轴学说。短链脂肪酸（Short chain fatty acids,SCFAs）是肠道菌群代谢产生的重要产物,在多种疾病中具有抗炎和抗氧化作用。在脓毒症患者中,体内SCFAs浓度与预后密切相关。由于肠道在脓毒症和脓毒症肾损伤的发展中扮演着重要作用,因此通过调节肠道菌群改善脓毒症及脓毒症诱导急性肾损伤是非常有意义的。腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）是能量代谢的主要传感器,调控转录共激活因子（PPARrcoactivator,PGC-1α）,在线粒体生物发生和线粒体稳态中起到重要作用。研究发现AMPK可能在脓毒症诱导的肾损伤发生和发展中起着重要的作用。AMPK是SCFAs重要的作用靶点,目前关于SCFAs在脓毒症诱导急性肾损伤中的作用及其机制尚不明确,为此本研究拟从动物和细胞水平探讨SCFAs对脓毒症诱导急性肾损伤的作用和潜在机制,为寻找肾损伤的有效治疗提供理论依据。方法:1.在动物实验中,C57BL/6小鼠腹腔注射SCFAs给药后,构建脓毒症诱导急性肾损伤模型（LPS腹腔注射）。分别于LPS注射后12 h、24 h、48 h和72 h处死小鼠。采用酶活性试剂盒检测小鼠血清中肾功能、肾损伤指标、组织中炎症因子及氧化应激相关指标水平;通过HE染色、透射电镜等观察肾组织形态及线粒体超微结构变化;应用TUNEL染色观察细胞凋亡情况;最后通过Western Blot及免疫组化明确AMPK、p-AMPK及PGC-1 α蛋白表达变化。2.在细胞实验中,为进一步明确乙酸钠是否通过提高AMPK表达起到肾保护作用,选择人肾小管上皮细胞（HK-2）作为研究对象,LPS诱导造成脓毒症肾损伤模型。将HK-2细胞分为空白组、LPS组、乙酸钠治疗组、乙酸钠+AMPK抑制剂（Compound C）治疗组。通过MTT法检测各组细胞活力;利用酶活性试剂盒检测细胞炎症因子及氧化应激相关指标水平;用荧光染色、流式细胞术等检测线粒体功能及形态变化;最后通过Western Blot和qPCR方法检测细胞中AMPK、p-AMPK 及 PGC-1α 通路相关核呼吸因子 1（Nuclear respiratory factor 1,NRF1）、线粒体转录因子 A（Mitochondrial transcription factor A,TFAM）、解偶联蛋白 2（Uncouplingprotein 2,UCP2）表达和 mRNA水平变化,明确乙酸钠是否通过激活AMPK调控线粒体功能,减轻细胞炎症反应及氧化应激损伤,对肾小管上皮细胞起到保护作用。结果:1.脓毒症诱导急性肾损伤小鼠炎症因子及氧化应激产物含量明显增多,肾小管上皮细胞空泡变性,ATP合成减少,线粒体膜电位下降,线粒体超微结构破坏,肾组织细胞凋亡明显,说明炎症反应、氧化应激和线粒体功能障碍是脓毒症诱导急性肾损伤发生发展中的关键环节。2.乙酸钠通过激活AMPK,上调PGC-1α蛋白表达,增加ATP生成及线粒体膜电位,改善线粒体微结构,调节线粒体功能,减轻肾组织炎症反应及氧化应激损伤。3.在细胞实验中,乙酸钠可显著逆转LPS诱导的HK-2细胞炎症反应及氧化应激损伤,增加ATP合成并上调PGC-1α、NRF1、TFAM、UCP2蛋白表达水平。4.乙酸钠联合AMPK抑制剂（Compound C）治疗后,乙酸钠对HK-2细胞的保护作用减轻,细胞炎症反应、氧化应激损伤及线粒体功能障碍加重,PGC-1α及NRF1、TFAM、UCP2蛋白表达明显下降。结论:本研究从动物和细胞水平证实短链脂肪酸-乙酸通过激活AMPK恢复线粒体功能、减轻炎症反应和氧化应激损伤,改善肾小管上皮细胞功能,对脓毒症诱导急性肾损伤起到保护作用。本研究为SCFAs在脓毒症诱导急性肾损伤的临床应用提供理论依据。