钝齿棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的克隆与表达

来源 :浙江工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wahahabookbb
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
本文建立了一种快速有效的泛酸及泛解酸在转化液中的HPLC检测方法。其最优条件为:采用色谱柱Agilent Zorbax SB-Aq柱(5μm,4.6×250mm);流动相为0.02mol/L KH2PO4-乙腈(V∶V=9∶1)pH5.5;流速:1.0mL/min;柱温:30℃;检测波长200nm,参比波长600nm;进样量:20μL。该条件下,泛酸和泛解酸的保留时间标准偏差分别为0.027%、0.040%,峰面积标准偏差分别为0.29%、0.19%。方法的线性范围试验显示:泛酸的线性方程y=125393.43x+14429.43,相关系数R2=0.9988,线性范围为0.100g/L-2.000g/L;泛解酸的线性方程y=1197.97x-113.86,相关系数R2=0.9992,线性范围0.100g/L-5.000g/L。泛酸回收率为87.22%~111.80%;泛解酸回收率为102.25%~91.32%。钝齿棒杆菌(C.crenatum)中编码L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD被克隆,并连接到质粒pEKEx2上构建了表达载体pEKEx2-panD,随后电击转化到该菌中,通过抗性平板筛选出重组质粒。提取重组质粒酶切鉴定发现有外源片段的插入。测序结果显示C.crenatum的panD序列与NCBI Gene Bank中的同属菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)序列有99%的同源率,软件预测的蛋白质序列则与其完全吻合。panD序列在C.crenatum与C.glutamicum间高度保守。其中优化了C.crenatum的电击转化条件,其最佳条件为2.5kV、200Ω、25μF、5ms,电击后培养时间3h,抗性筛选平板Kan浓度30μg/L。最高转化率达1.81 cfuμg-1DNA。C.crenatum/pEKEx2-panD工程菌的panD基因被诱导过量表达产生有活性的ADC蛋白,可以L-Asp为底物生成β-Ala,菌种分离纯化后β-Ala产量提高至76.47mg/L,稳定性增加。同时研究了工程菌的诱导表达及生物素的影响。该工程菌在基本培养基中的表达需添加诱导物,IPTG效果好于乳糖;完全培养基可使其自诱导,添加诱导物对产量影响较小。最佳诱导温度为28℃。生长因子生物素最佳浓度10mg/L。工程菌以L-Asp及泛解酸为底物合成泛酸,产量36.20μmol/L。抑制泛酸合成途径,可有效增加β-Ala残留量,达到398.57μmol/L。
其他文献
目的:观察左卡尼汀与促红细胞生成素联用治疗维持性血透肾性贫血的临床效果,为肾性贫血的治疗提供参考。方法:选择在我院行维持性血液透析治疗并出现肾性贫血的患者100例作为研
钳工是基本的加工技术之一,在机械制造行业中有着不可替代的重要作用。虽然钳工正在逐渐被现代化的机械设备所取代,但是在小批量的生产加工中,钳工仍然具有无法比拟的巨大优
本文以丙酮酸工业生产菌株Candida glabrata CCTCC M202019为研究模型,在完成全基因组测序、基因组功能注释和比较基因组学研究的基础上,构建了基因组规模代谢网络模型(Genom
合成了己二酸改性环氧丙烯酸酯颜料润湿分散剂;分析了催化剂、合成温度、稀释条件等影响因素;综述了其在UV固化涂料和胶印油墨上的应用。
目的:探讨术前内镜下注射纳米炭混悬注射液(carbon nanoparticles,CN)在腹腔镜下结直肠癌(colorectal cancer,CRC)根治术后标本淋巴结检出中的应用价值。方法:回顾性分析2013
近年来,吉林省农业企业的快速发展对当地农村经济发展起到非常大的作用。在企业快速发展的背景下,也出现了企业资金短缺、融资困难等问题。其中融资难成为目前吉林省农业企业发展的瓶颈因素之一,对吉林省经济发展造成了严重的影响。在此发展背景下,本文通过探讨吉林省农业企业融资的相关问题,以期提出改善其融资的针对性策略。通过对农业企业的发展背景、发展现状和经营特征分析,结合相关的金融理论,梳理本文的研究背景与理论
目的探讨精准护理在鼻咽癌靶向治疗患者中的应用效果。方法选取2017年11月~2018年10月在广西某肿瘤专科医院行靶向治疗的鼻咽癌患者66例,随机分成对照组33例与实验组33例。对
以重庆市北碚区其中1家水厂滤后水为实验对象,使用二氧化氯进行消毒,在保证消毒效果的情况下,测定不同二氧化氯投加浓度、不同消毒时间,枯水期和丰水期水中二氧化氯消毒副产
新媒体的迅速发展,在丰富了媒体形态的同时,也给传统媒体带来了很大压力,尤其是传统电视媒体,受到的影响不容小觑。但与此同时,新媒体的发展也为传统电视媒体带来了转型的契
目的Betatrophin是一种与糖脂代谢和胰岛素抵抗相关的分泌蛋白,近年来一些研究发现2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者血清Betatrophin水平升高,国外有研究显示,Betatrophin基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点rs2278426与T2DM相关,但国内尚未见相关报道。本研究旨