卵巢癌是常见的来源于女性生殖器官的恶性肿瘤之一,其致死率列居各类妇科肿瘤之首,严重地威胁女性的身体健康。卵巢癌起病隐匿,疾病早期往往缺乏特异的临床症状,因此早期诊断困难,确诊时往往已是肿瘤的晚期。目前,主要用手术联合化疗来治疗卵巢癌。然而,抗肿瘤药物对患者具有毒副作用且肿瘤细胞容易对其产生耐药性。因此,从天然植物中提取具有抗肿瘤活性的物质已经成为新的趋势。小檗碱,又称为黄连素,是一种异喹啉类生物碱,是从小檗属、黄连属植物的根茎中提取出的一种天然物质。近几年来,多项研究已表明,小檗碱在体外对乳腺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌等肿瘤细胞具有显著的抑制作用。小檗碱具有抑制肿瘤细胞生长；诱导肿瘤细胞凋亡；阻止肿瘤新生血管的生成；抑制肿瘤的转移等生理作用。而小檗碱发挥这些作用的机制仍需探讨。目前,在卵巢癌的广泛性细胞减灭术后,以铂类药物为基础的化疗方案常规应用于临床。然而,其所产生的耐药性逐渐增高,导致大部分卵巢癌患者治疗后出现复发或转移的现象,影响了患者的生活质量,降低了5年生存率。为了深入研究小檗碱对卵巢癌细胞的抑制作用及其与铂类药物对肿瘤细胞的联合作用,本课题进行了以下四个方面的工作：第一部分小檗碱对人卵巢癌细胞及正常输卵管上皮细胞生长的抑制作用本课题选用的是人卵巢癌HEY、SKOV3细胞系及输卵管上皮细胞FTE-187。通过四唑盐比色法(MTT)来检测小檗碱对人卵巢癌HEY、SKOV3细胞及输卵管上皮细胞FTE-187生长的抑制作用,并与顺铂对肿瘤细胞及输卵管上皮细胞的抑制作用进行对比。通过实验发现：(1)小檗碱对人卵巢癌HEY细胞的生长具有明显的抑制作用,这种作用呈时间依赖性及剂量依赖性。(2)顺铂对人卵巢癌HEY、SKOV3细胞的牛长具有较小檗碱弱的抑制作用。(3)小檗碱对输卵管上皮细胞FTE-187的毒副作用低于顺铂对其的毒副作用。以上结果表明了小檗碱对人卵巢癌HEY、SKOV3细胞系具有明显的抑制作用,并且其对肿瘤细胞的抑制作用较顺铂的抑制作用强。而小檗碱对输卵管上皮细胞FTE-187没有明显的毒性作用。因此,小檗碱抗肿瘤的机制值得我们深入研究。第二部分小檗碱对人卵巢癌细胞的细胞周期的影响及其作用机制抗肿瘤药物发挥作用的途径之一,便是阻滞肿瘤细胞的细胞周期。本课题利用流式细胞仪及Western Blotting来研究小檗碱及顺铂对人卵巢癌HEY、SKOV3细胞系的细胞周期的影响及机制。1、用PI染色经流式细胞仪检测经小檗碱或顺铂处理过的细胞后发现：(1)经小檗碱处理过的HEY、SKOV3细胞,流式细胞仪检测到G1期的细胞较对照组增多。(2)小檗碱联合顺铂作用于HEY、SKOV3细胞时,流式细胞仪检测到的G1期细胞较顺铂单独作用时增多。2、用Western Blotting方法检测小檗碱处理后的HEY、SKOV3细胞的与G1期停滞相关蛋白表达的变化：小檗碱下调了HEY、SKOV3细胞的cyclin E的表达,而上调了p21的表达。以上实验结果表明,小檗碱诱导人卵巢癌HEY、SKOV3细胞G1期阻滞。第三部分小檗碱对人卵巢癌细胞凋亡的影响除了导致细胞周期停滞,抗肿瘤药物还可通过诱导肿瘤细胞的凋亡来达到抑制肿瘤生长的目的。本部分采用Annexin V-PI双染法经流式细胞仪来检测经小檗碱、顺铂处理后的人卵巢癌HEY、SKOV3细胞的凋亡情况。并用Western Blotting法检测与凋亡相关的蛋白的表达情况。1、用流式细胞仪检测经Annexin V-PI双染色后的标本：(1)经小檗碱处理后,人卵巢癌HEY、SKOV3细胞的凋亡细胞百分数多于对照组。(2)经小檗碱及顺铂联合处理过的人卵巢癌HEY、SKOV3细胞的凋亡细胞百分数,多于顺铂单独处理的凋亡细胞百分数。2、用Western Blotting分析与凋亡相关基因的蛋白表达情况：(1)人卵巢癌HEY、SKOV3细胞经小檗碱处理后,bcl-2蛋白的表达水平较对照组下调,而bax蛋白的表达水平则上调。(2)小檗碱与顺铂联合作用时,人卵巢癌HEY、SKOV3细胞内bcl-2蛋白的表达水平较顺铂单独作用时明显下调,而bax蛋白的表达水平则较顺铂单独作用时上调。以上实验结果表明,小檗碱可以诱导人卵巢癌HEY、SKOV3细胞的凋亡,并且增加顺铂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用。通过对凋亡相关基因的蛋白表达情况的测定,发现小檗碱上调了bax蛋白的表达同时下调了bcl-2蛋白的表达。第四部分小檗碱影响同源重组修复关键蛋白RAD51的表达RAD51是细胞同源重组修复中的关键蛋白。小檗碱是否可以通过影响RAD51的表达来抑制肿瘤细胞的同源重组修复,从而达到抑制肿瘤生长的目的?我们推测小檗碱可以下调DNA损伤所诱导的RAD51的表达升高。采用Western Blotting法检测细胞内RAD51的表达水平。结果如下：经顺铂处理过的HEY细胞内RAD51的表达水平上升；而小檗碱和顺铂联合作用可降低细胞内RAD51的表达水平。以上结果表明,小檗碱可以抑制由顺铂等化疗药物引起的RAD51表达水平的升高,抑制了人卵巢癌HEY细胞的同源重组修复,增强了化疗药物的敏感性。