尽管肿瘤的分子生物学机理和肿瘤治疗方面已经取得了巨大的进展,肿瘤仍然是威胁公共健康的主要问题。由于早期诊断和治疗的开展,结肠癌(colorectal cancer,CRC)的发病率和死亡率呈逐年下降的趋势；尽管如此,结肠癌仍然是引起肿瘤相关性死亡的第三大病因。在结肠癌的治疗方面,常规结肠手术切除和不断发展的辅助性放化疗(chemo-radiotherapy, CRT)能有效提高生存率,但是CRC复发和转移仍然是肿瘤-相关性死亡的主要原因之一。CD133(prominin-1)是一个5跨膜蛋白,分子量为120kDa,经证实可以作为富集多种实体肿瘤组织中Cancer Stem Cell (CSC)的表面分子标记,这些肿瘤包括：脑肿瘤,前列腺癌[6],肝癌[7]以及结肠癌等。然而,一些研究者持有不同观点,认为CD133不能作为富集结肠癌CSC的表面分子标记,因为CD133的表达很广泛,在未分化和分化的结肠上皮中均有表达。近来大量的研究证实,CD133是一个有助于直结肠癌临床诊断及预后的重要预测指标。然而,CD133在直结肠癌转移中的作用和机制如何尚不明确,仍需阐明。以前的研究证明,转移性亚群在CD133+CD44+HCT116细胞中高度富集；并且与CD10+成纤维细胞的共培养,能明显增加CD133+HCT116细胞的体外侵袭和增殖能力,而CD133-HCT116细胞的体外侵袭和增殖能力无明显变化。这些结果提示CD133可能与直结肠癌的侵袭有关。本研究以直结肠癌肿瘤细胞中CD133+亚群为对象,研究其在直结肠癌侵袭转移中的作用及机制。首先,用Western blotting和流式细胞术检测了6种人直结肠癌细胞系中CD133的表达,证明在所有6种细胞系中都有CD133的表达。用流式细胞术分选HCT116和COL0320DM细胞的CD133+亚群和CD133-亚群,MTT法检测两个亚群的体外增殖能力,Transwell体外侵袭实验检测两个亚群的体外侵袭能力。与CD133-HCT116细胞相比,CD133+/high HCT116细胞具有较高的体外增殖和侵袭能力；与CD133-COLO320DM细胞相比,CD133+COLO320DM细胞具有较高的体外增殖能力。其次,用分选的携带不同标记的CD133+-GFP-COLO320DM亚群和CD133--RFP-COLO320DM亚群,以不同于原始群体的比例混合后继续培养,结果证明CD133+亚群对扩群起主要作用,CD133+细胞的比例在混群后逐渐恢复到分群前水平。随后的实验中,用CD133siRNA转染HCT116细胞从而下调CD133的表达,发现CD133下调后,HCT116细胞的体外侵袭能力明显降低,而体外增殖能力无明显变化。这些数据提示,CD133在结肠癌细胞系HCT116的侵袭中发挥重要作用,同时也反映出CD133的“表面标记作用”和其“功能作用”是两个不同的概念。文献报导显示多种信号通路与肿瘤细胞的侵袭相关。为寻找CD133调控的下游信号,本研究用Real-time PCR方法,检测siRNA下调CD133表达后,细胞内与增殖、侵袭及运动相关信号通路在RNA表达水平的改变,包括：Hif-1α,Hif-1p,cdc42,RhoA, Smad7, TIMP-1及TIMP-2。结果显示,在HCT116细胞中,siRNA下调CD133表达后,只有TIMP-2的表达明显下调而其他分子的表达没有明显变化。有研究证明MMP2与肝细胞癌中CD133相关的侵袭有关,TIMP-2是MMP2的有效抑制剂。大量研究证明MMP2,TIMP-2及MMP2/TIMP-2复合物在直结肠癌的生长和演进过程中发挥着重要而且复杂的作用[21-23]。因此,本研究又着重研究了TIMP-2在CD133相关性侵袭中的作用和机制。Western blotting检测CD133对TIMP-2表达的调节作用,结果证明HCT116细胞中CD133下调能明显降低TIMP-2蛋白水平的表达,进一步验证了Real-time PCR的检测结果。同时,我们检测了TIMP-2在CD133+/high HCT116细胞和CD133-HCT116细胞中的表达情况,然而两组之间TIMP-2的表达(mRNA和蛋白水平)没有明显差异。这进一步提示,CD133的“表面标记作用”和其“功能作用”是两个不同的概念。CD133通过不同的形式(分布、糖基化不同、截短体)发挥不同的作用。通过siRNA下调TIMP-2的表达,本研究观察TIMP-2对CD133的影响及对HCT116细胞体外生物学特性的作用。研究发现,随着TIMP-2的下调,在mRNA和蛋白水平上CD133的表达均未发现明显变化；TIMP-2的下调明显降低了HCT116细胞的体外侵袭能力,而对细胞体外增殖能力无明显影响。这些结果证明,下调的CD133通过降低TIMP-2的表达,从而使HCT116细胞的体外侵袭能力明显降低。本研究证明,CD133通过调节TIMP-2的表达,从而影响HCT116的体外侵袭能力。这些结果尚未见文献报道。综上所述,我们证明了CD133在直结肠癌细胞体外侵袭和增殖中的重要作用,并且证明CD133通过调节TIMP-2从而影响HCT116细胞的侵袭能力。本研究为深入了解CD133在直结肠癌中的作用和机制提供了理论依据,进而为全面研究和揭示这一分子在肿瘤侵袭转移中的作用及相关的诊断和治疗提供了基础。日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲,以及美国华裔科学家钱永健三人因为在绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)研究和应用方面做出的突出贡献而被授予2008年度诺贝尔化学奖。因为GFP无细胞毒性,所以广泛用于标记细胞,可进一步在活细胞水平、组织水平和整体生物体内水平,进行动态的、微量的和直观的观察、分析、检测。为满足各种各样研究的需要,科学家研发了多种GFP的衍生物,其中一种点突变衍生物(F64L),荧光强度增加称为EGFP(enhanced GFP)。EGFP及其衍生物已广泛应用于遗传学、神经生物学、再生医学[27]及肿瘤[28-30]等研究领域,特别是体内肿瘤生长、转移模型及肿瘤药物筛选、治疗效果等研究。但是外源绿色荧光蛋白表达对细胞本身特性的影响,未见专门报道。本研究利用慢病毒感染技术,在不同肿瘤细胞系中强制表达外源绿色荧光蛋白,成功建立了稳定表达外源绿色荧光蛋白的人结肠癌细胞系HCT116-GFP、HCT116-EGFP、COLO320DM-EGFP和DG6-EGFP。MTT法检测细胞体外增殖能力,外源GFP表达后,HCT116-EGFP细胞、COLO320DM-EGFP细胞细胞的体外增殖能力明显降低。细胞分析计数仪(CasyTT型)检测细胞大小的分布状况,结果显示外源绿色荧光蛋白表达后,HCT116-EGFP细胞体积增大：平均直径分别为14.53μm(HCT116)和18.28gm(HCT116-EGFP)。Transwell体外迁移实验检测细胞体外侵袭能力,外源绿色荧光蛋白表达后,HCT116-EGFP细胞的体外侵袭能力明显降低。综上所述,本研究证明外源绿色荧光蛋白可视化标记细胞后,可能会影响肿瘤细胞的生物特性,利用这些模型进行科研时,需注意对相关指标的影响。