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哺乳动物体表由皮肤及被毛覆盖,其中毛色的深浅变化及颜色差异受到外界环境,营养摄入,基因遗传等的影响,但黑色素合成的多少直接决定毛发的颜色。在色素相关研究中发现内皮素(Endothelin, EDN)作为一类由角化细胞合成的旁分泌因子,对未成熟的黑色素细胞主要发挥促分化并影响迁移的作用,对成熟的黑色素细胞则以刺激增殖分裂为主。尽管如此,对绵羊被毛黑色素合成的影响尚未见报道,对不同色素细胞的影响仍有待研究。本研究以不同毛色绵羊及不同的黑色素细胞为研究对象,运用多种生物学方法探索EDN3在绵羊不同毛色形成过程中的作用机制及其对色素生成的调控作用。(1)实时荧光定量PCR技术分析在不同毛色绵羊皮肤中EDN3的相对表达量,结果显示：全白绵羊皮肤中EDN3的表达量是黑色绵羊皮肤(黑白花斑绵羊)的4.8倍,是全黑绵羊皮肤表达量的5.5倍;绵羊白色皮肤(黑白花斑绵羊)EDN3的表达量是黑色皮肤(黑白花斑绵羊)的3.8倍,是全黑绵羊皮肤表达量的4.3倍。数据分析结果显示EDN3 mRNA在不同毛色绵羊皮肤中的表达差异极显著(P<0.01)。(2)通过ELISA检测EDN3在不同毛色绵羊皮肤中的蛋白表达量,结果显示：全白绵羊皮肤中EDN3的表达量是黑色皮肤(黑白花斑绵羊)的4.5倍,是全黑绵羊皮肤表达量的5.1倍；白色皮肤(黑白花斑绵羊)EDN3的表达量是黑色皮肤(黑白花斑绵羊)的3.3倍,是全黑绵羊皮肤的3.7倍。EDN3在白色绵羊皮肤与黑色绵羊皮肤的蛋白表达差异极显著(P<0.01)。(3)EDN3蛋白定位表达的结果可知,不同毛色绵羊皮肤的毛囊中有EDN3的正常表达,根据阳性反应颜色的深浅可判断EDN3主要表达部位为毛基质,内毛根鞘和外毛根鞘等处。(4)运用MTT法检测不同来源的黑色素细胞在不同浓度EDN3(10-10mol/L、10-9 mol/L、10-8mol/L、10-7 mol/L、10-6mol/L)影响下的增殖率。结果显示两种来源的黑色素细胞在EDN3的刺激下增值率均有所提高,但以EDN3浓度为10-8mol/L时细胞增殖率的提高达到了顶峰,随后浓度过高时(10-7,10-6)反而会对增殖率的提升产生了部分的抑制作用。比较两种细胞的增值率显示白色皮肤来源的黑色素细胞在EDN3为10-8mol/L时的增殖率明显高于黑色皮肤来源的黑色素细胞。(5)实时荧光定量PCR技术检测EDN3在10-8mol/L浓度时EDNRB、NRas、TYR基因mRNA相对表达量的变化。结果显示：添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB mRNA的相对表达量是正常细胞组的1.7992倍,NRas是正常细胞组的1.8536倍差异极显著(P<0.01),但TYR的表达量与正常组细胞相比几乎未发生变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB mRNA的相对表达量是正常细胞组的2.2512倍,NRas是正常细胞组的1.3859倍,TYR是正常细胞组的15.5710倍差异极显著(P<0.01)。(6) Western Blot检测EDNRB、NRas、TYR蛋白表达的结果显示：添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.0827倍差异极显著(P<0.01),NRas是正常细胞组的1.2936倍差异显著(P<0.05), TYR蛋白表达量未发生明显变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.9800倍差异极显著(P<0.01), NRas是正常细胞组的1.3658倍差异显著(P<0.05), TYR是正常细胞组的1.8498倍差异显著(P<0.05)。上述结果显示：EDN3在不同毛色绵羊皮肤中均可正常表达,且表达量存在显著的差异。EDN3促进白色来源的黑色素细胞增殖但对色素合成的限速酶TYR未产生促进作用；EDN3促进黑色来源的黑色素细胞增殖并可能促进黑色素生成。