金属纳米簇作为一种新型的荧光材料,近年来在发光分析和生物传感领域的应用受到人们的关注。铜纳米簇(CuNCs)因其成本低、易合成、生物相容性好等特点,在荧光传感领域显现出广阔的应用前景。但目前铜纳米簇作为荧光探针存在着荧光量子效率低和稳定性差等问题。本文以DNA稳定的铜纳米簇为研究对象,探索了提高此类探针荧光性能的方法,进而构建了新的生物传感系统。具体如下:一、铜纳米簇荧光法检测链霉亲和素本研究以3’端标记生物素的聚AT双链DNA为核酸外切酶Ⅲ的底物,基于链霉亲和素与生物素之间特异性的识别,建立了一种检测链霉亲和素的荧光新方法。当体系中加入靶分子链霉亲和素时,能够特异性结合生物素,这样可以抑制核酸外切酶Ⅲ对聚AT双链DNA的水解。随后,向体系加入Cu2+和抗坏血酸可以形成以双链DNA为模板的铜纳米簇,呈现出强的荧光信号;反之,双链DNA模板被核酸外切酶Ⅲ水解,不能形成铜纳米簇。因此,可以通过体系荧光强度的变化来测定链霉亲和素的浓度。此方法操作简单、成本低、灵敏度高、选择性好,提供了一种用于检测类似生物素与链霉亲和素模型识别作用的通用荧光方法,有望用于检测其它类型小分子与靶蛋白之间的相互作用。二、以DNA为模板的铜纳米簇荧光稳定性研究以双链DNA为模板合成的铜纳米簇(DNA-CuNCs)由于荧光稳定性差,限制了其在生物分析领域中的广泛应用。本论文系统研究了 DNA-CuNCs的稳定性,探索了影响DNA-CuNCs稳定性的因素,提出了增强其稳定性的方法。通过一系列的实验(如加入自由基清除剂、体系通氮气除氧、体系通氧气增氧)发现羟基自由基攻击模板DNA和氧气氧化单质铜是导致DNA-CuNCs稳定性差的主要原因。根据这些原因,提出并经实验确定可以通过减少与氧气接触的措施来提高DNA-CuNCs的稳定性,最后使DNA-CuNCs稳定性由几十分钟延长到了 20天。本研究有助于人们进一步认识铜纳米簇的荧光性能,从而促进DNA-CuNCs的广泛使用。三、组蛋白与DNA相互作用对铜纳米簇荧光性能的增强组蛋白(histones)是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质,可以与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。本研究发现在以双链DNA为模板合成铜纳米簇的过程中,加入组蛋白可以使DNA-CuNCs的荧光量子效率由2%提高到14.6%。我们通过圆二色光谱、光电子能谱、紫外-可见吸收光谱等手段,探索了组蛋白提高DNA-CuNCs荧光强度的原因。此外,组蛋白也可以显著提高DNA-CuNCs的光稳定性。最后,以DNA与组蛋白复合体为模板合成了量子产率高、稳定性好的铜纳米簇,并将此探针用于硫离子和TDT酶活性的检测。本研究提供了一种提高CuNCs荧光性能的方法,以便建立高灵敏荧光传感新体系。四、基于光电子诱导转移荧光法高灵敏度检测核酸外切酶Ⅲ活性本研究设计合成了 3’端标记荧光素(FAM)的聚GC单链DNA(5’-CGC GCG CG-FAM-3’),此DNA在反应介质中可自杂交生成双链DNA。在所形成的双链DNA中,G碱基与FAM之间发生光电子诱导转移,使FAM荧光熄灭。体系加入核酸外切酶Ⅲ,核酸外切酶Ⅲ可以沿3’→5’方向水解双链DNA生成单核苷酸,标记在3’端的荧光素游离到溶液中,不能发生光电子诱导转移,从而使FAM的荧光得以恢复。可以通过测定体系荧光强度的变化,检测核酸外切酶Ⅲ的活性。实验结果表明荧光强度与5×10-4-5U/mL的核酸外切酶Ⅲ呈良好线性关系,检出限为5×104U/mL。本方法简单、快捷、灵敏度高,还可用于核酸外切酶Ⅲ抑制剂的筛选以及海拉细胞内核酸外切酶Ⅲ的定性分析。